Внедрение секвенирования длинных чтений для диагностики редких заболеваний. (LongEpi)

После третьего национального плана по редким заболеваниям (PNMR3) основными целями PNMR4 являются снижение диагностической неопределенности и тупиковых ситуаций, а также усиление трансляционных исследований для содействия диагностике и разработке новых методов лечения в области редких заболеваний.

Для этого Французский план геномной медицины 2025 (PFMG2025) организует внедрение полногеномного секвенирования (WGS) в диагностических целях.

Этот технологический прорыв, охватывающий регионы за пределами кодирующих областей, недавно позволил идентифицировать вариации в гене RNU4-2 как основную причину нарушения интеллектуального развития (IDD), составляющую примерно 0,4% случаев. RNU4-2 — это ген, кодирующий малую ядерную РНК (snRNA), которая не транслируется в белок, и чьи вариации недоступны для методов секвенирования экзома.

Однако, основываясь на текущих знаниях, эти методы основаны на технологии секвенирования коротких прочтений и могут диагностировать до 50% пациентов. Поэтому необходимо разрабатывать новые методы для обнаружения вариаций, не идентифицированных этими методами.

В этом контексте развитие секвенирования третьего поколения, особенно с использованием технологии Nanopore, теперь позволяет сочетать геномные и постгеномные подходы посредством полногеномного секвенирования длинными прочтениями в сочетании с обнаружением метилированных цитозинов на нативной ДНК.

Этот новый подход, таким образом, позволяет одновременно обнаруживать точечные или структурные геномные варианты, аномалии метилирования и реконструкцию гаплотипа. Многочисленные исследования показали, что эта стратегия повышает уровень диагностики редких заболеваний и может стать генетическим тестом первой линии.

Метилирование ДНК — это эпигенетическая модификация, которая не вызывает изменений в геномной последовательности, но регулирует транскрипцию (синтез РНК) генов и, следовательно, их экспрессию. Исследования метилирования проводятся либо для установления эписигнатуры, либо для поиска аномалий метилирования. Эписигнатура — это результат вариации в гене, известном как регулятор метилирования.

Аномалии метилирования уже известны и исследуются при целенаправленном анализе для определенных заболеваний, таких как синдромы Прадера-Вилли/Ангельмана и синдромы Беквита-Видемана/Сильвера-Рассела. Вклад анализа метилирования в диагностику других заболеваний недавно был продемонстрирован. Например, при метилмалоновой ацидурии и гомоцистинурии типа cblC, связанной с аутосомно-рецессивным геном MMACHC, анализ метилирования промотора выявил гиперметилирование, связанное с присутствием интронного варианта гена PRDX1. Этот интронный вариант приводит к синтезу аберрантной антисмысловой РНК, перекрывающей промотор гена MMACHC, вызывая его гиперметилирование. В 2024 году комбинированный полногеномный и метилированный анализ у пациентов с порокератозом привел к открытию гена FDFT1. В целом, изучение профилей метилирования показало свою ценность в снижении диагностической неопределенности у пациентов с редкими заболеваниями, которые не были диагностированы после геномного анализа.

Поиск аномалий метилирования (или эпимутаций) на пангеномном уровне в контексте молекулярной диагностики редких заболеваний остается в значительной степени недоступным и плохо описанным в литературе. Методы, обычно используемые для их обнаружения, чаще всего основаны на бисульфитной обработке и ПЦР-амплификации. Недостатки бисульфитной обработки заключаются в том, что она разрушает ДНК, препятствуя применению длинных прочтений, не различает метилирование 5mC и 5hmC, а неудачная обработка неметилированных цитозинов может привести к ложноположительным результатам. Кроме того, определение фазы с геномным вариантом, идентифицированным в коротких прочтениях, требует дополнительных методов, таких как SNP-микрочипы.

Таким образом, этот подход представляется значительным технологическим прорывом в борьбе с диагностической неопределенностью при редких заболеваниях и является частью перехода к прецизионной медицине для пациентов.

В рамках нашего Референс-центра по аномалиям развития и синдромам мальформаций Юго-Западной Окситании Реюньон (CRMR ADSOOR) в Университетской больнице Бордо мы развили клиническую и молекулярную экспертизу, особенно в области аномалий развития с нарушениями интеллектуального развития (в частности, хроматинопатий и синдрома Рубинштейна-Тайби и альбинизма).

В 2024 году в CRMR было проведено 2300 консультаций. Кроме того, в нашей лаборатории молекулярной биологии было интерпретировано 243 и 228 анализов генома или экзома для альбинизма и нарушения интеллектуального развития и синдрома мальформаций соответственно.

Таким образом, наша экспертиза в этих двух областях представляет собой лучшую отправную точку для разработки этого пилотного проекта с использованием этого инновационного подхода в Университетской больнице Бордо.