Mise en œuvre du séquençage long-read pour le diagnostic des maladies rares. (LongEpi)

Suite au troisième plan national pour les maladies rares (PNMR3), les principaux objectifs du PNMR4 sont de réduire l'incertitude diagnostique et les impasses, et de renforcer la recherche translationnelle pour favoriser le diagnostic et le développement de nouveaux traitements dans le domaine des maladies rares.

À cette fin, le Plan France Médecine Génomique 2025 (PFMG2025) organise le déploiement du séquençage du génome entier (SGE) à des fins diagnostiques.

Cette avancée technologique, couvrant les régions en dehors des régions codantes, a récemment permis d'identifier les variations du gène RNU4-2 comme une cause majeure du trouble du développement intellectuel (TDI), représentant environ 0,4 % des cas. RNU4-2 est un gène codant pour un petit ARN nucléaire (snRNA), qui n'est pas traduit en protéine, et dont les variations ne sont pas accessibles aux techniques de séquençage de l'exome.

Cependant, sur la base des connaissances actuelles, ces techniques reposent sur la technologie de séquençage à lectures courtes et peuvent diagnostiquer jusqu'à 50 % des patients. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles techniques pour détecter les variations non identifiées par ces méthodes.

Dans ce contexte, le développement du séquençage de troisième génération, notamment avec la technologie Nanopore, permet désormais de combiner des approches génomiques et post-génomiques grâce au séquençage du génome entier en lectures longues couplé à la détection des cytosines méthylées sur l'ADN natif.

Cette nouvelle approche permet donc la détection simultanée de variants génomiques ponctuels ou structuraux, d'anomalies de méthylation, et la reconstruction des haplotypes. De nombreuses études ont montré que cette stratégie améliore le taux de diagnostic des maladies rares et pourrait devenir un test génétique de première intention.

La méthylation de l'ADN est une modification épigénétique qui ne provoque pas de changements dans la séquence génomique mais régule la transcription (synthèse d'ARN) des gènes et donc leur expression. Les études de méthylation sont réalisées soit pour établir une épisignature, soit pour rechercher des anomalies de méthylation. Une épisignature est le résultat d'une variation dans un gène connu pour réguler les marques de méthylation.

Les anomalies de méthylation sont déjà connues et recherchées dans l'analyse ciblée pour certaines maladies comme les syndromes de Prader-Willi/Angelman et les syndromes de Beckwith-Wiedemann/Silver-Russell. L'apport de l'analyse de la méthylation au diagnostic d'autres maladies a récemment été démontré. Par exemple, dans l'acidurie méthylmalonique et l'homocystinurie de type cblC associées au gène autosomique récessif MMACHC, l'analyse de la méthylation du promoteur a révélé une hyperméthylation liée à la présence d'un variant intronique du gène PRDX1. Ce variant intronique conduit à la synthèse d'un ARN antisens aberrant chevauchant le promoteur du gène MMACHC, provoquant son hyperméthylation. En 2024, l'analyse combinée du génome entier et de la méthylation chez des patients atteints de porokératose a conduit à la découverte du gène FDFT1. De manière générale, l'étude des profils de méthylation a montré son intérêt pour réduire l'incertitude diagnostique chez les patients atteints de maladies rares non diagnostiqués après l'analyse du génome.

La recherche d'anomalies de méthylation (ou épimutation) au niveau pangénomique dans le cadre du diagnostic moléculaire des maladies rares reste largement inaccessible et peu décrite dans la littérature. Les techniques couramment utilisées pour leur détection reposent le plus souvent sur un traitement au bisulfite et une amplification par PCR. Les inconvénients du traitement au bisulfite sont qu'il dégrade l'ADN, empêchant les applications en lectures longues, qu'il ne distingue pas la méthylation 5mC de la 5hmC, et qu'un défaut de traitement des cytosines non méthylées peut conduire à des faux positifs. De plus, la détermination de la phase avec un variant génomique identifié en lectures courtes nécessite des techniques complémentaires comme les puces à SNP.

Cette approche apparaît donc comme une avancée technologique majeure dans la lutte contre l'incertitude diagnostique des maladies rares et s'inscrit dans la démarche vers une médecine de précision pour les patients.

Dans le cadre de notre Centre de Référence pour les Anomalies du Développement et Syndromes Malformatifs du Sud-Ouest Occitanie Réunion (CRMR ADSOOR) au CHU de Bordeaux, nous avons développé une expertise clinique et moléculaire, notamment dans le domaine des anomalies du développement avec troubles du développement intellectuel (en particulier les chromatopathies et le syndrome de Rubinstein Taybi) et l'albinisme.

En 2024, 2 300 consultations ont été réalisées au CRMR. De plus, 243 et 228 analyses de génome ou d'exome ont été interprétées dans notre laboratoire de biologie moléculaire pour l'albinisme et le trouble du développement intellectuel et syndrome malformatif, respectivement.

Notre expertise dans ces deux domaines représente donc le meilleur point de départ pour le développement de ce projet pilote utilisant cette approche innovante au CHU de Bordeaux.