Pitkien lukujaksojen sekvensoinnin käyttöönotto harvinaisten sairauksien diagnosoinnissa. (LongEpi)

Kolmannen harvinaisten sairauksien kansallisen suunnitelman (PNMR3) jälkeen PNMR4:n päätavoitteet ovat vähentää diagnostiikkaan liittyvää epävarmuutta ja umpikujia sekä vahvistaa translatiivista tutkimusta edistääkseen diagnoosia ja uusien hoitomuotojen kehittämistä harvinaisten sairauksien alalla.

Tätä varten Ranskan genomiikkalääketieteen suunnitelma 2025 (PFMG2025) organisoi kokogenomisekvensoinnin (WGS) käyttöönoton diagnostisiin tarkoituksiin.

Tämä teknologinen saavutus, joka kattaa koodaavien alueiden ulkopuoliset alueet, on äskettäin mahdollistanut RNU4-2-geenin variaatioiden tunnistamisen merkittäväksi kehitysvammaisuuden (IDD) syyksi, joka vastaa noin 0,4 % tapauksista. RNU4-2 on geeni, joka koodaa pientä tuma-RNA:ta (snRNA), jota ei käännetä proteiiniksi ja jonka variaatiot eivät ole saatavilla eksomisekvensointimenetelmillä.

Kuitenkin nykyisten tietojen perusteella nämä menetelmät perustuvat lyhyiden lukujen sekvensointitekniikkaan ja voivat diagnosoida jopa 50 % potilaista. Siksi on tarpeen kehittää uusia tekniikoita tunnistaakseen näillä menetelmillä tunnistamattomia variaatioita.

Tässä yhteydessä kolmannen sukupolven sekvensoinnin kehitys, erityisesti Nanopore-teknologian avulla, mahdollistaa nyt genomiisten ja postgenomiisten lähestymistapojen yhdistämisen pitkien lukujen kokogenomisekvensoinnin kautta, joka on yhdistetty metylöityjen sytosiinien havaitsemiseen luonnollisesta DNA:sta.

Tämä uusi lähestymistapa mahdollistaa siis piste- tai rakenteellisten genomisten varianttien, metylaatiopoikkeavuuksien ja haplotyypin rekonstruktion samanaikaisen havaitsemisen. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että tämä strategia parantaa harvinaisten sairauksien diagnoosiprosenttia ja voisi tulla ensimmäisen linjan geneettiseksi testiksi.

DNA-metylaatio on epigeneettinen muutos, joka ei aiheuta muutoksia genomisessa sekvenssissä, mutta säätelee geenien transkriptiota (RNA-synteesiä) ja siten niiden ilmentymistä. Metylaatiotutkimuksia suoritetaan joko episignatuurin määrittämiseksi tai metylaatiopoikkeavuuksien etsimiseksi. Episignatuuri on tulosta geenvariaatiosta, joka tunnetaan metylaatiomerkkien säätelijänä.

Metylaatiopoikkeavuuksia tunnetaan ja niitä etsitään jo kohdennetussa analyysissä tietyissä sairauksissa, kuten Prader-Willin/Angelmanin oireyhtymissä ja Beckwith-Wiedemannin/Silver-Russellin oireyhtymissä. Metylaatioanalyysin merkitys muiden sairauksien diagnosoinnissa on äskettäin osoitettu. Esimerkiksi metylimalonihappoasidoosissa ja homokystinuriassa tyyppiä cblC, joka liittyy autosomaaliseen resessiiviseen MMACHC-geeniin, promoottorin metylaatioanalyysi paljasti hypermetylaation, joka liittyy PRDX1-geenin intronisen variantin läsnäoloon. Tämä introninen variantti johtaa poikkeavan antisense-RNA:n synteesiin, joka limittyy MMACHC-geenin promoottoriin, aiheuttaen sen hypermetylaation. Vuonna 2024 yhdistetty kokogenomi- ja metylaatioanalyysi porokeratoosipotilailla johti FDFT1-geenin löytämiseen. Yleisesti ottaen metylaatioprofiilien tutkimus on osoittanut arvonsa vähentämällä diagnostiikkaan liittyvää epävarmuutta harvinaisia sairauksia sairastavilla potilailla, joille ei ole tehty diagnoosia genomanalyysin jälkeen.

Metylaatiopoikkeavuuksien (tai epimutaation) etsiminen pangenomisella tasolla harvinaisten sairauksien molekyylidiagnostiikassa on edelleen suurelta osin saavuttamaton ja huonosti kuvattu kirjallisuudessa. Rutiininomaisesti käytetyt tekniikat niiden havaitsemiseksi perustuvat useimmiten bisulfiittikäsittelyyn ja PCR-amplifikaatioon. Bisulfiittikäsittelyn haittoja ovat, että se hajottaa DNA:ta, estäen pitkien lukujen sovellukset, että se ei erota 5mC- ja 5hmC-metylaatiota, ja että käsittelemättömien sytosiinien vuoksi voi ilmetä vääriä positiivisia tuloksia. Lisäksi vaiheen määrittäminen lyhyiden lukujen tunnistetun genomisen variantin kanssa vaatii täydentäviä tekniikoita, kuten SNP-taulukoita.

Tämä lähestymistapa näyttää siis olevan merkittävä teknologinen edistysaskel taistelussa harvinaisten sairauksien diagnostiikkaan liittyvää epävarmuutta vastaan ja on osa siirtymistä tarkkailääketieteeseen potilaille.

Osa Bordeaux'n yliopistollisen sairaalan Lounais-Oksitanian Ranskan merentakaisen alueen kehityshäiriöiden ja epämuodostumaoireyhtymien viitekeskustamme (CRMR ADSOOR) olemme kehittäneet kliinistä ja molekyylistä asiantuntemusta, erityisesti kehityshäiriöiden alalla, joihin liittyy älyllisen kehityksen häiriöitä (erityisesti kromatinopatiat ja Rubinstein-Taybin oireyhtymä sekä albiinismi).

Vuonna 2024 CRMR:ssä suoritettiin 2300 konsultaatiota. Lisäksi 243 ja 228 genomi- tai eksomianalyysiä tulkittiin molekyylibiologian laboratoriossamme albiinismille ja älyllisen kehityksen häiriölle ja epämuodostumaoireyhtymälle, vastaavasti.

Asiantuntemuksemme näillä kahdella alueella edustaa siis parasta lähtökohtaa tämän pilottihankkeen kehittämiselle tätä innovatiivista lähestymistapaa käyttäen Bordeaux'n yliopistollisessa sairaalassa.