Wdrożenie sekwencjonowania długich odczytów w diagnostyce chorób rzadkich. (LongEpi)

W kontynuacji trzeciego krajowego planu dla chorób rzadkich (PNMR3), głównymi celami PNMR4 są zmniejszenie niepewności diagnostycznej i ślepych zaułków oraz wzmocnienie badań translacyjnych w celu promowania diagnozy i rozwoju nowych metod leczenia w dziedzinie chorób rzadkich.

W tym celu Francuski Plan Genomiki Medycznej 2025 (PFMG2025) organizuje wdrożenie sekwencjonowania całego genomu (WGS) w celach diagnostycznych.

Ten kamień milowy technologiczny, obejmujący regiony poza regionami kodującymi, niedawno umożliwił identyfikację wariacji w genie RNU4-2 jako głównej przyczyny Zaburzeń Rozwoju Intelektualnego (IDD), odpowiadających za około 0,4% przypadków. RNU4-2 jest genem kodującym mały jądrowy RNA (snRNA), który nie jest tłumaczony na białko, a którego wariacje nie są dostępne dla technik sekwencjonowania eksomowego.

Jednakże, na podstawie obecnej wiedzy, te techniki opierają się na technologii sekwencjonowania krótkich odczytów i mogą diagnozować do 50% pacjentów. Dlatego konieczne jest opracowanie nowych technik do wykrywania wariacji nieidentyfikowanych przez te techniki.

W tym kontekście rozwój sekwencjonowania trzeciej generacji, szczególnie z wykorzystaniem technologii Nanopore, umożliwia obecnie połączenie podejść genomowych i postgenomowych poprzez sekwencjonowanie całego genomu długimi odczytami połączone z wykrywaniem zmetylowanych cytozyn na natywnym DNA.

To nowe podejście umożliwia zatem jednoczesne wykrywanie punktowych lub strukturalnych wariantów genomowych, nieprawidłowości metylacji oraz rekonstrukcję haplotypów. Liczne badania wykazały, że ta strategia poprawia wskaźnik diagnozy chorób rzadkich i mogłaby stać się testem genetycznym pierwszej linii.

Metylacja DNA jest modyfikacją epigenetyczną, która nie powoduje zmian w sekwencji genomowej, ale reguluje transkrypcję (syntezę RNA) genów, a zatem ich ekspresję. Badania metylacji przeprowadza się albo w celu ustalenia episygnatury, albo w poszukiwaniu nieprawidłowości metylacji. Episygnatura jest wynikiem wariacji w genie znanym z regulowania znaków metylacji.

Nieprawidłowości metylacji są już znane i poszukiwane w analizach ukierunkowanych dla niektórych chorób, takich jak zespoły Pradera-Williego/Angelmana i zespoły Beckwitha-Wiedemanna/Silvera-Russella. Wkład analizy metylacji w diagnozę innych chorób został niedawno wykazany. Na przykład, w kwasicy metylomalonowej i homocystynurii typu cblC związanej z autosomalnym recesywnym genem MMACHC, analiza metylacji promotora ujawniła hipermetylację związaną z obecnością intronowego wariantu genu PRDX1. Ten intronowy wariant prowadzi do syntezy aberracyjnego antysensownego RNA nakładającego się na promotor genu MMACHC, powodując jego hipermetylację. W 2024 roku połączona analiza całogenomowa i metylacji u pacjentów z porokeratozą doprowadziła do odkrycia genu FDFT1. Ogólnie rzecz biorąc, badanie profili metylacji wykazało swoją wartość w zmniejszaniu niepewności diagnostycznej u pacjentów z chorobami rzadkimi, którzy nie zostali zdiagnozowani po analizie genomowej.

Poszukiwanie nieprawidłowości metylacji (lub epimutacji) na poziomie pangemonowym w kontekście diagnostyki molekularnej chorób rzadkich pozostaje w dużej mierze niedostępne i słabo opisane w literaturze. Techniki rutynowo stosowane do ich wykrywania najczęściej opierają się na traktowaniu bisulfitem i amplifikacji PCR. Wady traktowania bisulfitem polegają na tym, że degraduje on DNA, uniemożliwiając zastosowania długich odczytów, nie rozróżnia on metylacji 5mC i 5hmC, a nieprzetworzenie niemetylowanych cytozyn może prowadzić do wyników fałszywie pozytywnych. Dodatkowo, określenie fazy z wariantem genomicznym zidentyfikowanym w krótkich odczytach wymaga technik uzupełniających, takich jak macierze SNP.

To podejście wydaje się zatem znaczącym postępem technologicznym w walce z niepewnością diagnostyczną w chorobach rzadkich i wpisuje się w dążenie do medycyny precyzyjnej dla pacjentów.

W ramach naszego Centrum Referencyjnego Anomalii Rozwojowych i Zespołów Malformacyjnych Południowo-Zachodniej Oksytanii Réunion (CRMR ADSOOR) w Szpitalu Uniwersyteckim w Bordeaux, rozwinęliśmy ekspertyzę kliniczną i molekularną, szczególnie w dziedzinie anomalii rozwojowych z zaburzeniami rozwoju intelektualnego (szczególnie chromatynopatie oraz zespół Rubinsteina-Taybiego i albinizm).

W 2024 roku w CRMR przeprowadzono 2 300 konsultacji. Dodatkowo, 243 i 228 analiz genomu lub eksomu zostało zinterpretowanych w naszym laboratorium biologii molekularnej odpowiednio dla albinizmu oraz zaburzeń rozwoju intelektualnego i zespołów malformacyjnych.

Nasza ekspertyza w tych dwóch obszarach stanowi zatem najlepszy punkt wyjścia do rozwoju tego projektu pilotażowego z wykorzystaniem tego innowacyjnego podejścia w Szpitalu Uniwersyteckim w Bordeaux.