Implementação de Sequenciação de Leitura Longa para o Diagnóstico de Doenças Raras. (LongEpi)

Na sequência do terceiro plano nacional para doenças raras (PNMR3), os principais objetivos do PNMR4 são reduzir a incerteza diagnóstica e os becos sem saída e reforçar a investigação translacional para promover o diagnóstico e o desenvolvimento de novos tratamentos no campo das doenças raras.

Para tal, o Plano Francês de Medicina Genómica 2025 (PFMG2025) está a organizar a implementação do sequenciamento completo do genoma (WGS) para fins de diagnóstico.

Este marco tecnológico, abrangendo regiões fora das regiões codificantes, permitiu recentemente a identificação de variações no gene RNU4-2 como uma causa principal do Transtorno do Desenvolvimento Intelectual (IDD), representando aproximadamente 0,4% dos casos. RNU4-2 é um gene que codifica um pequeno RNA nuclear (snRNA), que não é traduzido em proteína, e cujas variações não são acessíveis às técnicas de sequenciamento do exoma.

No entanto, com base no conhecimento atual, estas técnicas baseiam-se na tecnologia de sequenciamento de leitura curta e podem diagnosticar até 50% dos pacientes. É, portanto, necessário desenvolver novas técnicas para detetar variações não identificadas por estas técnicas.

Neste contexto, o desenvolvimento do sequenciamento de terceira geração, particularmente utilizando a tecnologia Nanopore, permite agora combinar abordagens genómicas e pós-genómicas através do sequenciamento completo do genoma de leitura longa acoplado à deteção de citosinas metiladas no DNA nativo.

Esta nova abordagem permite, assim, a deteção simultânea de variantes genómicas pontuais ou estruturais, anomalias de metilação e a reconstrução de haplotipos. Numerosos estudos demonstraram que esta estratégia melhora a taxa de diagnóstico de doenças raras e poderia tornar-se um teste genético de primeira linha.

A metilação do DNA é uma modificação epigenética que não causa alterações na sequência genómica, mas regula a transcrição (síntese de RNA) dos genes e, portanto, a sua expressão. Os estudos de metilação são realizados quer para estabelecer uma episignatura, quer para procurar anomalias de metilação. Uma episignatura é o resultado de uma variação num gene conhecido por regular as marcas de metilação.

As anomalias de metilação já são conhecidas e procuradas na análise dirigida para certas doenças, como as síndromes de Prader-Willi/Angelman e as síndromes de Beckwith-Wiedemann/Silver-Russell. A contribuição da análise de metilação para o diagnóstico de outras doenças foi recentemente demonstrada. Por exemplo, na acidúria metilmalónica e homocistinúria tipo cblC associada ao gene autossómico recessivo MMACHC, a análise da metilação do promotor revelou hipermetilação ligada à presença de uma variante intrónica do gene PRDX1. Esta variante intrónica leva à síntese de um RNA antisenso aberrante que se sobrepõe ao promotor do gene MMACHC, causando a sua hipermetilação. Em 2024, a análise combinada do genoma completo e da metilação em pacientes com poroceratose levou à descoberta do gene FDFT1. Em geral, o estudo dos perfis de metilação demonstrou o seu valor na redução da incerteza diagnóstica em pacientes com doenças raras que não foram diagnosticados após a análise do genoma.

A procura de anomalias de metilação (ou epimutação) ao nível pan-genómico no contexto do diagnóstico molecular de doenças raras permanece largamente inacessível e pouco descrita na literatura. As técnicas rotineiramente utilizadas para a sua deteção baseiam-se, na maioria das vezes, no tratamento com bissulfito e na amplificação por PCR. As desvantagens do tratamento com bissulfito são que degrada o DNA, impedindo aplicações de leitura longa, que não distingue entre metilação 5mC e 5hmC, e que a falha no tratamento das citosinas não metiladas pode levar a falsos positivos. Além disso, a determinação da fase com uma variante genómica identificada em leituras curtas requer técnicas complementares, como microarrays de SNP.

Esta abordagem parece, portanto, constituir um grande avanço tecnológico na luta contra a incerteza diagnóstica nas doenças raras e integra-se na transição para a medicina de precisão para os pacientes.

No âmbito do nosso Centro de Referência para Anomalias do Desenvolvimento e Síndromes de Malformação do Sudoeste da Occitânia Reunião (CRMR ADSOOR) no Hospital Universitário de Bordéus, desenvolvemos uma experiência clínica e molecular, particularmente no campo das anomalias do desenvolvimento com transtornos do desenvolvimento intelectual (especialmente cromatinopatias e síndrome de Rubinstein Taybi e albinismo).

Em 2024, foram realizadas 2.300 consultas no CRMR. Além disso, 243 e 228 análises de genoma ou exoma foram interpretadas no nosso laboratório de biologia molecular para albinismo e para transtorno do desenvolvimento intelectual e síndrome de malformação, respetivamente.

A nossa experiência nestas duas áreas representa, portanto, o melhor ponto de partida para o desenvolvimento deste projeto piloto utilizando esta abordagem inovadora no Hospital Universitário de Bordéus.