Implementatie van Long-read Sequencing voor de Diagnose van Zeldzame Ziekten. (LongEpi)

Voortbouwend op het derde nationale plan voor zeldzame ziekten (PNMR3), zijn de belangrijkste doelstellingen van PNMR4 het verminderen van diagnostische onzekerheid en doodlopende wegen, en het versterken van translationeel onderzoek om diagnose en de ontwikkeling van nieuwe behandelingen op het gebied van zeldzame ziekten te bevorderen.

Hiertoe organiseert het Franse Genoomgeneeskundeplan 2025 (PFMG2025) de uitrol van whole-genoom sequencing (WGS) voor diagnostische doeleinden.

Deze technologische mijlpaal, die gebieden buiten de coderende regio's omvat, heeft recentelijk de identificatie van variaties in het RNU4-2-gen mogelijk gemaakt als een belangrijke oorzaak van intellectuele ontwikkelingsstoornis (IDD), goed voor ongeveer 0,4% van de gevallen. RNU4-2 is een gen dat codeert voor een kleine nucleaire RNA (snRNA), dat niet wordt vertaald in eiwit, en waarvan de variaties niet toegankelijk zijn voor exoomsequencingtechnieken.

Op basis van huidige kennis zijn deze technieken echter gebaseerd op short-read sequencingtechnologie en kunnen ze tot 50% van de patiënten diagnosticeren. Het is daarom noodzakelijk om nieuwe technieken te ontwikkelen om variaties te detecteren die niet door deze technieken worden geïdentificeerd.

In deze context maakt de ontwikkeling van derde-generatie sequencing, met name met behulp van Nanopore-technologie, het nu mogelijk om genomische en post-genomische benaderingen te combineren via long-read whole-genoom sequencing gekoppeld aan de detectie van gemethyleerde cytosines op inheems DNA.

Deze nieuwe aanpak maakt daarom de gelijktijdige detectie van punt- of structurele genomische varianten, methylatieafwijkingen en haplotype-reconstructie mogelijk. Talrijke studies hebben aangetoond dat deze strategie de diagnoserate van zeldzame ziekten verbetert en een eerstelijns genetische test zou kunnen worden.

DNA-methylatie is een epigenetische modificatie die geen veranderingen in de genomische sequentie veroorzaakt, maar de transcriptie (RNA-synthese) van genen en dus hun expressie reguleert. Methylatiestudies worden uitgevoerd om een episignatuur vast te stellen of om methylatieafwijkingen op te sporen. Een episignatuur is het resultaat van een variatie in een gen waarvan bekend is dat het methylatiemarkeringen reguleert.

Methylatieafwijkingen zijn al bekend en worden gezocht in gerichte analyse voor bepaalde ziekten zoals het syndroom van Prader-Willi/Angelman en het syndroom van Beckwith-Wiedemann/Silver-Russell. De bijdrage van methylatieanalyse aan de diagnose van andere ziekten is recentelijk aangetoond. Bijvoorbeeld, bij methylmalonzuuracidurie en homocystinurie type cblC geassocieerd met het autosomaal recessieve gen MMACHC, onthulde promotor-methylatieanalyse hypermethylatie gekoppeld aan de aanwezigheid van een intronische variant van het PRDX1-gen. Deze intronische variant leidt tot de synthese van een aberrant antisense RNA dat overlapt met de promotor van het MMACHC-gen, wat hypermethylatie veroorzaakt. In 2024 leidde gecombineerde whole-genoom- en methylatieanalyse bij patiënten met porokeratose tot de ontdekking van het FDFT1-gen. In het algemeen heeft de studie van methylatieprofielen zijn waarde aangetoond bij het verminderen van diagnostische onzekerheid bij patiënten met zeldzame ziekten die niet zijn gediagnosticeerd na genoomanalyse.

Het zoeken naar methylatieafwijkingen (of epimutatie) op pan-genoomniveau in de context van moleculaire diagnose van zeldzame ziekten blijft grotendeels ontoegankelijk en slecht beschreven in de literatuur. De technieken die routinematig worden gebruikt voor hun detectie zijn meestal gebaseerd op bisulfietbehandeling en PCR-amplificatie. De nadelen van bisulfietbehandeling zijn dat het DNA degradeert, wat long-read toepassingen verhindert, dat het geen onderscheid maakt tussen 5mC- en 5hmC-methylatie, en dat het niet behandelen van ongemethyleerde cytosines kan leiden tot vals-positieven. Bovendien vereist fasebepaling met een genomische variant geïdentificeerd in short reads aanvullende technieken zoals SNP-arrays.

Deze aanpak lijkt daarom een belangrijke technologische vooruitgang te zijn in de strijd tegen diagnostische onzekerheid bij zeldzame ziekten en maakt deel uit van de beweging naar precisiegeneeskunde voor patiënten.

Als onderdeel van ons Referentiecentrum voor Ontwikkelingsafwijkingen en Malformatiesyndromen van Zuidwest Occitanië Réunion (CRMR ADSOOR) in het Universitair Ziekenhuis van Bordeaux, hebben wij klinische en moleculaire expertise ontwikkeld, met name op het gebied van ontwikkelingsafwijkingen met intellectuele ontwikkelingsstoornissen (vooral chromatopathieën en het syndroom van Rubinstein Taybi en albinisme.

In 2024 werden 2.300 consultaties uitgevoerd bij het CRMR. Daarnaast werden respectievelijk 243 en 228 genoom- of exoomanalyses geïnterpreteerd in ons moleculair biologielaboratorium voor albinisme en intellectuele ontwikkelingsstoornis en malformatiesyndroom.

Onze expertise op deze twee gebieden vormt daarom het beste uitgangspunt voor de ontwikkeling van dit pilotproject met deze innovatieve aanpak in het Universitair Ziekenhuis van Bordeaux.