Implementierung von Long-read-Sequenzierung für die Diagnose seltener Erkrankungen. (LongEpi)

Im Anschluss an den dritten nationalen Plan für seltene Erkrankungen (PNMR3) sind die Hauptziele des PNMR4, die diagnostische Unsicherheit und Sackgassen zu reduzieren und die translationale Forschung zu stärken, um die Diagnose und die Entwicklung neuer Behandlungen im Bereich der seltenen Erkrankungen zu fördern.

Zu diesem Zweck organisiert der französische Plan für Genommedizin 2025 (PFMG2025) die Einführung der Ganzgenomsequenzierung (WGS) für diagnostische Zwecke.

Dieser technologische Meilenstein, der Regionen außerhalb der kodierenden Regionen abdeckt, hat kürzlich die Identifizierung von Variationen im RNU4-2-Gen als eine Hauptursache für intellektuelle Entwicklungsstörungen (IDD) ermöglicht, die etwa 0,4 % der Fälle ausmachen. RNU4-2 ist ein Gen, das eine kleine nukleare RNA (snRNA) kodiert, die nicht in Protein übersetzt wird und deren Variationen für Exomsequenzierungstechniken nicht zugänglich sind.

Auf der Grundlage des derzeitigen Wissens basieren diese Techniken jedoch auf der Kurzlese-Sequenzierungstechnologie und können bis zu 50 % der Patienten diagnostizieren. Es ist daher notwendig, neue Techniken zu entwickeln, um Variationen zu erkennen, die von diesen Techniken nicht identifiziert werden.

In diesem Kontext ermöglicht die Entwicklung der Sequenzierung der dritten Generation, insbesondere unter Verwendung der Nanopore-Technologie, nun die Kombination genomischer und postgenomischer Ansätze durch Ganzgenomsequenzierung mit langen Leseweiten gekoppelt mit der Detektion von methylierten Cytosinen auf nativem DNA.

Dieser neue Ansatz ermöglicht daher die gleichzeitige Detektion von punktuellen oder strukturellen genomischen Varianten, Methylierungsanomalien und Haplotyp-Rekonstruktion. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass diese Strategie die Diagnoserate von seltenen Erkrankungen verbessert und zu einem genetischen Test der ersten Wahl werden könnte.

DNA-Methylierung ist eine epigenetische Modifikation, die keine Veränderungen in der genomischen Sequenz verursacht, aber die Transkription (RNA-Synthese) von Genen und damit ihre Expression reguliert. Methylierungsstudien werden entweder durchgeführt, um eine Episignatur zu etablieren oder um nach Methylierungsanomalien zu suchen. Eine Episignatur ist das Ergebnis einer Variation in einem Gen, das bekanntermaßen Methylierungsmarken reguliert.

Methylierungsanomalien sind bereits bekannt und werden in gezielten Analysen für bestimmte Erkrankungen wie Prader-Willi/Angelman-Syndrome und Beckwith-Wiedemann/Silver-Russell-Syndrome gesucht. Der Beitrag der Methylierungsanalyse zur Diagnose anderer Erkrankungen wurde kürzlich demonstriert. Beispielsweise zeigte bei Methylmalonazidurie und Homocystinurie Typ cblC, die mit dem autosomal-rezessiven Gen MMACHC assoziiert sind, die Promotor-Methylierungsanalyse eine Hypermethylierung, die mit dem Vorhandensein einer intronischen Variante des PRDX1-Gens verbunden ist. Diese intronische Variante führt zur Synthese einer aberranten Antisense-RNA, die den Promotor des MMACHC-Gens überlappt und dessen Hypermethylierung verursacht. Im Jahr 2024 führte die kombinierte Ganzgenom- und Methylierungsanalyse bei Patienten mit Porokeratose zur Entdeckung des FDFT1-Gens. Im Allgemeinen hat die Untersuchung von Methylierungsprofilen ihren Wert bei der Reduzierung der diagnostischen Unsicherheit bei Patienten mit seltenen Erkrankungen gezeigt, die nach Genomanalyse nicht diagnostiziert wurden.

Die Suche nach Methylierungsanomalien (oder Epimutationen) auf pangénomischer Ebene im Kontext der molekularen Diagnose seltener Erkrankungen bleibt weitgehend unzugänglich und in der Literatur schlecht beschrieben. Die routinemäßig für ihren Nachweis verwendeten Techniken basieren meist auf Bisulfit-Behandlung und PCR-Amplifikation. Die Nachteile der Bisulfit-Behandlung sind, dass sie DNA abbaut, was Langlese-Anwendungen verhindert, dass sie nicht zwischen 5mC- und 5hmC-Methylierung unterscheidet und dass das Ausbleiben der Behandlung unmethylierter Cytosine zu falsch positiven Ergebnissen führen kann. Darüber hinaus erfordert die Phasenbestimmung mit einer in kurzen Leseweiten identifizierten genomischen Variante ergänzende Techniken wie SNP-Arrays.

Dieser Ansatz erscheint daher als ein bedeutender technologischer Fortschritt im Kampf gegen die diagnostische Unsicherheit bei seltenen Erkrankungen und ist Teil der Bewegung hin zur Präzisionsmedizin für Patienten.

Im Rahmen unseres Referenzzentrums für Entwicklungsanomalien und Fehlbildungssyndrome des Südwestens Okzitanien Réunion (CRMR ADSOOR) am Universitätsklinikum Bordeaux haben wir klinische und molekulare Expertise entwickelt, insbesondere im Bereich der Entwicklungsanomalien mit intellektuellen Entwicklungsstörungen (insbesondere Chromatinopathien und Rubinstein-Taybi-Syndrom und Albinismus).

Im Jahr 2024 wurden 2.300 Konsultationen am CRMR durchgeführt. Darüber hinaus wurden in unserem molekularbiologischen Labor jeweils 243 und 228 Genom- oder Exomanalysen für Albinismus sowie für intellektuelle Entwicklungsstörung und Fehlbildungssyndrom interpretiert.

Unsere Expertise in diesen beiden Bereichen stellt daher den besten Ausgangspunkt für die Entwicklung dieses Pilotprojekts unter Verwendung dieses innovativen Ansatzes am Universitätsklinikum Bordeaux dar.