Implementación de la Secuenciación de Lectura Larga para el Diagnóstico de Enfermedades Raras. (LongEpi)

A raíz del tercer plan nacional para enfermedades raras (PNMR3), los principales objetivos del PNMR4 son reducir la incertidumbre diagnóstica y los callejones sin salida, y reforzar la investigación traslacional para fomentar el diagnóstico y el desarrollo de nuevos tratamientos en el ámbito de las enfermedades raras.

Con este fin, el Plan Francés de Medicina Genómica 2025 (PFMG2025) está organizando el despliegue de la secuenciación del genoma completo (WGS) con fines diagnósticos.

Este hito tecnológico, que abarca regiones fuera de las regiones codificantes, ha permitido recientemente identificar variaciones en el gen RNU4-2 como una causa principal del Trastorno del Desarrollo Intelectual (TDI), representando aproximadamente el 0,4% de los casos. RNU4-2 es un gen que codifica un ARN nuclear pequeño (snRNA), que no se traduce en proteína, y cuyas variaciones no son accesibles a las técnicas de secuenciación del exoma.

Sin embargo, según el conocimiento actual, estas técnicas se basan en la tecnología de secuenciación de lecturas cortas y pueden diagnosticar hasta el 50% de los pacientes. Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevas técnicas para detectar variaciones no identificadas por estos métodos.

En este contexto, el desarrollo de la secuenciación de tercera generación, en particular mediante la tecnología Nanopore, permite ahora combinar enfoques genómicos y postgenómicos a través de la secuenciación del genoma completo de lecturas largas acoplada con la detección de citosinas metiladas en ADN nativo.

Este nuevo enfoque permite, por tanto, la detección simultánea de variantes genómicas puntuales o estructurales, anomalías de metilación y la reconstrucción de haplotipos. Numerosos estudios han demostrado que esta estrategia mejora la tasa de diagnóstico de enfermedades raras y podría convertirse en una prueba genética de primera línea.

La metilación del ADN es una modificación epigenética que no provoca cambios en la secuencia genómica, pero regula la transcripción (síntesis de ARN) de los genes y, por tanto, su expresión. Los estudios de metilación se realizan ya sea para establecer una episignatura o para buscar anomalías de metilación. Una episignatura es el resultado de una variación en un gen conocido por regular las marcas de metilación.

Las anomalías de metilación ya son conocidas y buscadas en análisis dirigidos para ciertas enfermedades como los síndromes de Prader-Willi/Angelman y los síndromes de Beckwith-Wiedemann/Silver-Russell. La contribución del análisis de metilación al diagnóstico de otras enfermedades se ha demostrado recientemente. Por ejemplo, en la aciduria metilmalónica y homocistinuria tipo cblC asociada al gen autosómico recesivo MMACHC, el análisis de metilación del promotor reveló hipermethylación vinculada a la presencia de una variante intrónica del gen PRDX1. Esta variante intrónica conduce a la síntesis de un ARN antisentido aberrante que se superpone al promotor del gen MMACHC, causando su hipermethylación. En 2024, el análisis combinado de genoma completo y metilación en pacientes con poroqueratosis llevó al descubrimiento del gen FDFT1. En general, el estudio de los perfiles de metilación ha demostrado su valor para reducir la incertidumbre diagnóstica en pacientes con enfermedades raras que no han sido diagnosticados tras el análisis genómico.

La búsqueda de anomalías de metilación (o epimutación) a nivel pan-genómico en el contexto del diagnóstico molecular de enfermedades raras sigue siendo en gran medida inaccesible y poco descrita en la literatura. Las técnicas utilizadas rutinariamente para su detección se basan con mayor frecuencia en el tratamiento con bisulfito y la amplificación por PCR. Las desventajas del tratamiento con bisulfito son que degrada el ADN, impidiendo aplicaciones de lecturas largas, que no distingue entre metilación 5mC y 5hmC, y que el fallo en tratar las citosinas no metiladas puede llevar a falsos positivos. Además, la determinación de fase con una variante genómica identificada en lecturas cortas requiere técnicas complementarias como los arrays de SNP.

Este enfoque aparece, por tanto, como un avance tecnológico importante en la lucha contra la incertidumbre diagnóstica en enfermedades raras y se enmarca en la transición hacia la medicina de precisión para los pacientes.

Como parte de nuestro Centro de Referencia para Anomalías del Desarrollo y Síndromes Malformativos del Suroeste de Occitania Reunión (CRMR ADSOOR) en el Hospital Universitario de Burdeos, hemos desarrollado experiencia clínica y molecular, particularmente en el campo de las anomalías del desarrollo con trastornos del desarrollo intelectual (especialmente cromatinopatías y síndrome de Rubinstein Taybi y albinismo).

En 2024, se realizaron 2.300 consultas en el CRMR. Además, se interpretaron 243 y 228 análisis de genoma o exoma en nuestro laboratorio de biología molecular para albinismo y trastorno del desarrollo intelectual y síndrome malformativo, respectivamente.

Nuestra experiencia en estas dos áreas representa, por tanto, el mejor punto de partida para el desarrollo de este proyecto piloto que utiliza este enfoque innovador en el Hospital Universitario de Burdeos.