ガロタンニンが腸内細菌叢に及ぼす影響と、肥満者における炎症マーカーへの影響

導入背景 肥満は深刻で一般的かつ費用のかかる慢性疾患であり、疾病管理予防センターの報告によると、米国では成人の5人中2人以上が肥満とともに生活している。 米国における肥満問題は増加傾向にあり、2017年から2020年までの米国成人（20歳以上）の肥満有病率は41.9％で、2000年の30.5％から上昇したことが報告されている。 同時に、重度肥満の有病率も4.7％から9.2％に増加した。 これは米国で1億人以上の成人が肥満とともに生活し、2200万人以上が重度肥満とともに生活していることを意味する。

肥満の主な原因は、多くの臓器や組織、特に内臓や腹部領域（白色脂肪組織を含む）における異常かつ過剰な脂質蓄積であり、これは腹部肥満と呼ばれる。 糖尿病、代謝機能障害関連脂肪性肝疾患（MAFLD）、心血管疾患、高血圧、腎疾患など、多くの重要な非感染性疾患は、このタイプの肥満に大きく影響される。 肥満における主要な病原性メカニズムの一つとして、脂肪形成障害、すなわち脂肪細胞分化のプロセスの障害が提唱されている。

酸化ストレスと炎症の増加は、不健康な白色脂肪組織リモデリングのさらなる特徴である。 組織学的クラウン様構造（CLS）は、肥大した脂肪細胞がケモカインを放出し、主にマクロファージなどの免疫細胞を引き寄せて脂肪細胞を囲むことで形成される。 このメカニズムは、核内因子κB（NF-κB）などの炎症促進調節因子を活性化し、炎症遺伝子の産生を促進してインターロイキン10（IL10）などの抗炎症調節因子を圧倒することで、過炎症状態を悪化させる。 さらに、活性酸素種（ROS）誘発性酸化ストレスは抗酸化調節を上回ることがあり、特に核内因子エリスロイド2関連因子2（NFE2L2/NRF2）を介した抗酸化遺伝子の発現に影響する。

酸化ストレスと炎症の両方が、インスリン抵抗性、脂質異常症、脂肪形成障害などの代謝問題を引き起こす。 したがって、脂肪細胞肥大を回避し、正常な脂肪細胞を生成するための脂肪形成を改善し、有害な白色脂肪組織リモデリングを逆転させ、酸化ストレスと炎症を制限する方法は、肥満とメタボリックシンドロームに対抗する効果的な方法となりうる。

肥満予防と管理のための食事介入の使用は長年にわたって行われ、研究者によって基礎的なものとされてきた。 エネルギー密度が低く生物活性化学物質が豊富な果物や野菜を含む食事や天然物を摂取することが、肥満とそれに関連する問題を管理する方法として提案されている。 さまざまな地域の食用野生果物や野菜には、フェノール類を含む多様な生物活性物質が含まれており、抗炎症、抗酸化、代謝調節効果を持つ可能性があることが知られている。 ケルセチン、カテキン、ルチンなどのフラボノイドやポリフェノールを含む果物抽出物は、代謝機能障害のマーカーに良好な効果を示している。 肥満の動物モデルでは、脂肪細胞とマクロファージの減少、脂質蓄積、内臓脂肪組織、炎症および酸化ストレスのマーカーの減少が含まれる。

マンゴー（Mangifera indica L.）に含まれるフェノール物質（没食子酸、ガロタンニン、ガロイルグリコシド、フラボノイドなど）の高濃度は、強力な抗酸化および抗炎症の可能性を示しており、マンゴー由来のポリフェノールが肥満に関連する慢性疾患の予防に役立つことを示唆している。 前臨床研究では、高脂肪食を与えたラットにおいて、マンゴー摂取は肥満を減少させ、脂質プロファイル、グルコース耐性、炎症性サイトカイン発現を改善した。 3T3-L1前脂肪細胞を用いたin vitroモデルによると、マンゴー抽出物による脂肪形成抑制は、脂肪細胞分化の開始における重要な段階である有糸分裂クローン増殖の減少と最も関連している可能性が高い。

ヒト臨床研究でも、マンゴー補給が肥満者、2型糖尿病患者、および健康な成人の血糖値を低下させ、脂質プロファイルと抗酸化能を改善することが示されている。 高血糖を伴う過体重者では、マンゴー果実の天然植物化学物質（マンギフェリンなど）とその代謝物がHDLレベルを上昇させ、トリグリセリドと遊離脂肪酸レベルを低下させることが実証されている。 これらの結果によると、マンゴーから抽出されたポリフェノールは強力な抗炎症および抗脂肪生成特性を持ち、肥満に関連する慢性疾患の予防に役立つ可能性がある。

問題提起 世界的に、肥満は複雑で多変量の代謝問題の流行となり、2型糖尿病、心臓病、およびいくつかのがんなどの慢性疾患の有病率増加を引き起こしている。 変化した腸内微生物生態学（ディスバイオーシス）と持続的な低度炎症状態は、肥満の病態生理学の重要な構成要素である。 短鎖脂肪酸（SCFA）を産生する有益な細菌の減少、炎症促進分類群の増加、微生物多様性の減少は、このディスバイオティック状態の一般的な特徴であり、すべてが代謝機能障害と全身性炎症の維持に寄与する可能性がある。 肥満者の炎症を軽減し微生物バランスを回復させるために、食事介入を作成することへの関心が高まっている。

ポリフェノール、特にマンゴーに含まれるガロタンニン（GT）は、抗炎症、抗酸化、プレバイオティクス様特性でよく知られている。 腸内微生物によって分解された後、GTは有益な細菌の増殖を促進し有害な細菌の増殖を抑制する可能性があるが、正確な効果は各個人の微生物叢の構成に依存する可能性がある。 同様に、Lactiplantibacillus pentosusは腸管粘膜の完全性を強化し免疫機能を調節するが、単独での効果はしばしば一貫性がない。

Lactiplantibacillus pentosus LPG1（以下LPG1）は、テーブルオリーブのバイオフィルムから派生した発酵物であり、in vitroおよびin vivo（マウスモデル）研究でプロバイオティクス特性を示している。 この菌株は、抗炎症性とフィターゼ特性を持ち、コレステロールレベルを低下させ、食中毒菌を阻害し、Caco-2細胞に付着し、溶血活性がないなどの特徴を持つ。 さらに、臨床研究でヒトにおける安全性が実証されている。 この点に関して、最近の研究では、L. pentosus LPG1ゲノムには抗生物質耐性および病原性遺伝子が欠如している一方、多くの潜在的に有益な細菌、バクテリオシン、エクソポリサッカライド、葉酸産生クラスター遺伝子、ガラクトース、グリコーゲン、デンプン、セルロース、キシランなどの複雑な炭水化物を分解できる消化酵素を含むことが発見された。

Lactiplantibacillus株のプロバイオティクス能力は、ヒト臨床試験ですでに研究されている。 Kotaniは、発酵茶葉から単離されたL. pentosus b240が高齢者の唾液免疫グロブリンA分泌を刺激できる能力を調査した。 Wangは、経口Lactiplantibacillus pentosus Lp-8摂取が糞便微生物叢の構成に与える影響を調査した。 de Vosは、いくつかのL. pentosus株の経口摂取が免疫応答に与える影響を研究し、Rudzkiは、経口L. pentosus 299がうつ病患者の認知能力に与える影響を調査した。 最近、Ahnは、キムチから単離されたL. pentosus株がアレルゲン感受性アトピー性皮膚炎の子供に与える影響を調査し、参加者の症状改善を示した。

肥満者で経験的に探求されていないが、微生物から得られる代謝物の相乗的調節または炎症指標の減衰の可能性は特に興味深い。 このパイロット研究は、GT抽出物が、L. pentosus補給の有無にかかわらず、肥満成人の腸内微生物叢と炎症に及ぼす影響をin vitroで評価することで、このギャップを埋めることを目的としている。 結果は、ポリフェノール-プロバイオティクス併用療法が単剤療法よりも多くの健康上の利点を提供できるかどうかを明らかにし、将来の個別化栄養と肥満管理のアプローチを導く。

研究の意義 慢性低度炎症と乱れた腸内微生物生態学は、肥満と関連代謝疾患の発症と進行における重要な要因であることが現在理解されている。 肥満予防と治療努力の進歩は、これらの相互に関連した機能障害の効果的な管理にかかっている。 人気のある熱帯果物であるマンゴー（Mangifera indica L.）は、特にガロタンニン（GT）が豊富であり、抗炎症、抗酸化、代謝調節、プレバイオティクス様特性を持つことが示されている加水分解性ポリフェノールのサブクラスである。 しかし、GTが腸内微生物によって吸収可能で健康増進的な代謝物に生体変換されることは、その生物活性の主要な要因である。 微生物構成は個人間で異なるため、マンゴー由来のポリフェノールの潜在的な利点は集団全体で一貫して達成されるわけではない。

よく特徴付けられたプロバイオティクスLactiplantibacillus pentosusの補給は、ポリフェノール代謝の不均一性に対処する実行可能な方法を提供する。 このプロバイオティクスは、GTなどの複雑なフェノール性化学物質の分解を助け、腸管バリアの完全性を改善し、免疫応答を調節する可能性がある。 L. pentosusはGTと連携して有益な代謝物のバイオアベイラビリティを増加させ、腸内微生物生態学に良好な影響を与える可能性がある。 これはその後、熱産生および抗炎症効果を強化し、特に肥満者において、より良い腸の健康、炎症性バイオマーカーレベルの低下、改善された代謝プロファイルとして現れる可能性がある。

この発見は、いくつかの分野に重要な影響を与える。 腸内微生物叢を介して宿主代謝を変化させるように設計された併用ポリフェノール-プロバイオティクスアプローチを評価することで、栄養科学は機能性食品と栄養補助食品の成長分野を前進させる。 微生物構成と個々の代謝応答に基づく肥満の個別化食事療法を支持する情報を提供し、精密栄養の原則と一致する。 公衆衛生の観点から、結果は感受性グループにおける慢性疾患のリスクを低下させる食品ベースの拡張可能な方法の開発に役立つ。 肥満は依然として心血管疾患、2型糖尿病、およびいくつかのがんの重要な危険因子である。 したがって、代謝および炎症転帰を改善する天然由来で文化的に受け入れられ容易にアクセス可能な食事介入を見つけることは、特に恵まれない環境において、経済的な疾病予防および管理方法となりうる。

慢性疾患研究において、この研究は食事性ポリフェノールとプロバイオティクスが全身性炎症と代謝機能障害に影響を与える役割に関する機構的洞察を提供する。 肥満および他の非感染性疾患の標準治療モデルに微生物叢標的治療を組み込むことを目的とした将来の臨床試験を導くのに役立つ可能性がある。 この研究はまた、果物および農業産業、特にマンゴーや他のポリフェノール豊富な果物の機能特性を促進することに影響を与える。 成功すれば、この研究は健康増進食品としてのマンゴーの市場性を高め、需要を駆動し、ポリフェノール強化食品製品の開発を促進する。 さらに、結果は果物作物における生物活性化合物含有量を増加させることを目的とした農業慣行に情報を提供できる。

マンゴーを超えて、この研究は、スーマックなどの他のポリフェノール豊富な果物における類似の相互作用を調査する基盤を築き、研究の関連性を多様な文化的および地理的食事状況に広げる。 微生物叢研究の分野では、この研究は食事性生物活性化合物が特定の微生物分類群と相互作用して宿主の健康に影響を与える機能性代謝物を生成する方法についての理解を進める。 肥満者における微生物多様性、SCFA産生細菌、および炎症関連微生物経路についての理解を深める。 最後に、この研究はトランスレーショナル栄養研究の実践的な例を提供することで教育および学習目標に貢献する。 分子栄養学、微生物学、行動科学を組み合わせており、学際的公衆衛生および生物医学科学における学生と実践者の訓練のための優れたケーススタディとなる。 統合的で食品ベースの解決策を使用して複雑な健康問題を解決するために必要なシステム思考アプローチを促進する。

研究課題

この調査を導くために、研究は以下の質問を通じて、マンゴーからのGT抽出物とLactiplantibacillus pentosus補給が肥満者の腸内微生物叢と炎症にどのように影響するかを理解することに焦点を当てる：

• GTによる治療（L. pentosusの有無にかかわらず）は、肥満成人の腸内微生物構成にどのように影響するか？
• GTとL. pentosus補給は、肥満者の炎症性バイオマーカーにどのような影響を与えるか？
• 肥満者間の遺伝的変異は、ガロタンニン代謝を説明するか。
• GTとL. pentosusの併用は、各介入単独と比較して、肥満および炎症に関連する特定の微生物分類群を調節する相乗効果を示すか？

仮説

1. ボディマス指数（BMI）とGTおよび代謝物の血漿濃度、ならびに熱産生および抗炎症活性の間に逆相関があると予想される。
2. L. pentosusはガロタンニンの有益な効果を増強すると予想される。

目的と目標 主目的 このパイロット研究の主目的は、マンゴー由来のガロタンニン（GT）が、プロバイオティクスL. pentosusの補給の有無にかかわらず、肥満者の腸内微生物叢構成と炎症マーカーに及ぼす影響をin vitroで調査することである。

具体的目標

1. GT抽出物による治療（L. pentosus補給の有無にかかわらず）後の肥満参加者の腸内微生物叢構成の変化を評価する。
2. GTとL. pentosusの個別および併用の抗炎症可能性を評価する。
3. 介入群間で微生物多様性、SCFA産生細菌の存在量、および炎症マーカー変化を比較することで、GTとL. pentosusの間の潜在的な相乗効果を特定する。

正当性 乱れた腸内微生物生態学と慢性低度炎症は肥満と密接に関連しており、両方が代謝疾患の発症と進行に関与している。 肥満を効果的に管理するには、これらの相互に関連した代謝異常に対処することが不可欠である。 マンゴーはガロタンニン（GT）の豊富な供給源であり、抗炎症、代謝調節、プレバイオティクス様特性を持つことが実証されている。 しかし、宿主がそれらを生物活性誘導体に変換する能力（腸内微生物叢の構成に応じて異なる能力）が、それらの健康上の利点に重要である。

Lactiplantibacillus pentosusプロバイオティクス補給は、この代謝的制約を克服する強力なアプローチを提供する。 粘膜バリア機能を強化し、免疫応答を調節し、おそらくポリフェノール代謝を助けることで、L. pentosusは腸の健康を促進する可能性を示している。 したがって、このプロバイオティクスをGTが豊富なマンゴーと組み合わせることで、有益なGT代謝物への全身的曝露を増加させる可能性がある。 血漿および脂肪組織サンプルで観察されるように、微生物調節と増強された代謝物バイオアベイラビリティの併用作用は、特に肥満者において、より顕著な熱産生および抗炎症効果を生み出す可能性がある。

予想される利点にもかかわらず、L. pentosus補給後に観察される炎症または代謝の変化が、単に上昇したGT代謝物レベルによるものではない可能性があることを認識することが重要である。 プロバイオティクス自体が、宿主の免疫系を修飾したり、炎症を引き起こす細菌と直接競合したりするなど、独自に生物学的効果を持つ可能性がある。 したがって、この研究の目的は、GT特異的経路を特定することではなく、実践的で統合的な設定においてプロバイオティクス補給とGT豊富な食品の間の機能的相互作用を調査することである。

腸内微生物叢標的治療と個別化栄養への関心の高まりを考慮すると、この研究は必要かつ時宜を得たものである。 ポリフェノールとプロバイオティクスの相互作用が、慢性疾患のリスクが最も高いグループの重要な代謝および炎症マーカーにどのように影響するかについての基本的な情報を提供する。 最終的に、結果は、微生物叢を意識した技術を使用して肥満者の健康転帰を向上させるように設計された食事推奨と補給計画に影響を与える可能性がある。

方法論 研究デザイン この研究はヒト臨床試験である。 研究デザインは無作為化二重盲検プラセボ対照である。 参加者は唾液、血液、糞便などのヒトサンプルを提供するよう求められる。 この研究はPrairie View A&M大学（PVAMU）およびTexas A&M大学の施設内審査委員会（IRB）によって承認され、www.Clinicaltrials.govに登録される。

研究集団 合計20人のボランティアがこの研究に募集され、介入群として肥満者15人、対照群として健康な痩せた個人5人が含まれる。 介入群では、15人のボランティアが3群に無作為化され、各群n=5人の参加者となる。 募集は、Waller郡および周辺郡の食料品店、スーパーマーケット、教会、コミュニティセンター、その他のイベントセンターなどの主要な場所で募集チラシを配布することで行われる。 参加者は研究に募集する前にスクリーニング質問を受ける。

機器 正確なデータ収集と分析を確保するために、さまざまな機器が使用される。 頬粘膜細胞はIsohelix SK-1 DNA頬粘膜スワブで収集され、生物学的サンプル（血漿、尿、糞便）は適切な条件下で-80℃で保存される。 炎症および代謝バイオマーカーは、Luminex L200システムおよびxPONENTソフトウェアでの分析を伴うマルチプレックスビーズベースアッセイを使用して測定される。 ジェノタイピングは、選択されたSNP変異を検出するためのTaqManアッセイで実施される。 微生物叢プロファイリングは、Qiagen QIAamp DNA Stool Mini KitによるDNA抽出、Illuminaプラットフォーム（MiSeqまたはNovaSeq）でのシーケンシング、QIIME2、SILVA/Greengenesデータベース、LEfSe、およびPICRUSt2を使用した分析によって実行される。 ガロタンニン代謝物の化学分析は、Thermo Finnigan Altisトリプル四重極およびHPLC-MS高分解能イオントラップを使用したHPLC-ESI-MSnで実施される。 最後に、ex vivo免疫アッセイは、末梢血単核細胞をLPSで刺激することを含み、サイトカインレベルはxMAPマルチプレックスアッセイで定量化される。

サンプル収集 血漿サンプルはベースライン時、一晩絶食後の第1週に収集される。 血漿のアリコートは取得直後に調製され、分析まで-80℃で保存される。 糞便は入手可能な限り収集され、直ちに嫌気的に処理される。 参加者はベースライン時にIsohelix SK-1 DNA頬粘膜スワブおよびIsohelix乾燥カプセルを使用して頬粘膜細胞サンプルを収集する。

サンプル分析 炎症および代謝マーカー 血漿サンプルは、さまざまな炎症性バイオマーカーレベルを評価するために分析される。 これらには、インターロイキン10（IL-10）、単球走化性タンパク質1（MCP-1）などの炎症性サイトカイン、および心血管マーカーC反応性タンパク質（CRP）が含まれる。 すべての測定はマルチプレックスビーズベースアッセイ（Millipore, Billerica, MA）を使用して実行される。

ジェノタイピング DNAおよびジェノタイピングされた特定の遺伝子座は、TaqManジェノタイピングアッセイを使用して抽出され、以下の遺伝子の一塩基多型の二対立遺伝子スコアリングを提供する：脂肪質量および肥満関連[FTO（rs9939609）]および脂肪酸不飽和化酵素1[FADS1（rs174546）]。

微生物叢アッセイ 微生物DNAは、Qiagen QIAamp DNA Stool Mini Kitを使用して糞便サンプルから抽出される。 16S rRNA遺伝子シーケンシング（V3-V4領域）は、Illumina MiSeqプラットフォームを使用して実施される。 より深い分析のために、ショットガンメタゲノムシーケンシングがIllumina NovaSeqプラットフォームを使用して考慮される。 シーケンスデータはQuantitative Insights Into Microbial Ecology（QIIME）2を使用して処理される。 分類学的分類はSILVAまたはGreengenesデータベースを利用する。

多様性指数：

• アルファ多様性はShannonおよびChao1指数を使用して計算される。
• ベータ多様性はBray-CurtisおよびUniFrac距離を使用して評価される。

差動存在量分析はLEfSeを使用して実行され、予測される微生物機能はR studioを使用したPhylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States（PICRUSt2）を介して推測される。

化学分析 GT代謝物は、まず遠心分離してバイオマスを除去し、次に内部標準としてエチルガレートを使用して酢酸エチルで抽出することで単離される。 MSパラメータは、利用可能な場合は予測される代謝物の標準を使用して最適化され、最高強度の親/娘フラグメントの同定に使用される。 標的代謝物は、内部標準を使用したThermo Finnigan Thermo Finnigan Altisトリプル四重極でのHPLC-ESI-MSnでのフルスキャン、SRM（単一イオン）、およびMRM（多反応モニタリング）を使用して定量化される。 非標的代謝物または低濃度代謝物は、Texas A&MメタボロミクスコアラボラトリーでHPLC-MS高分解能イオントラップを使用して同定/定量化される。

統計分析 すべての統計検定は0.05水準で実行され、両側検定となる。 データは正規性について検査され、すべての非正規変数はlog10変換される。 分析はintention to treat（ITT）に基づいて行われる。 クロスオーバーデザインのANOVA手法、および必要に応じて同等のWilcoxon順位和検定で補完される。 ベースラインからの絶対変化が検定され、二次分析はベースラインからのパーセント変化に基づいて実行される。 主要アウトカムは血漿中の炎症バイオマーカーの変化であり、このアウトカムは痩せた個人と肥満者の両方に適用される。 調査される他のすべてのアウトカムは二次アウトカムとして扱われる。 治療効果のさらなる二次分析は、患者のベースライン特性に基づく共分散分析を使用する。 バランスの取れた実験デザインを維持するために、患者の半分を無作為に2つの治療順序のそれぞれに割り当てる。 ブロック無作為化は、無作為化と治療割り当てのバランスを保護し、可能なバイアスを排除し、盲検化を維持するために混合ブロック番号として行われる。 各ブロックは個人で構成される。

倫理的考慮事項 倫理的承認は、募集とデータ収集に進む前に、Texas A&M大学およびPrairie A&M大学の施設内審査委員会（IRB）から求められ承認されている。 この研究はヒト被験者を含むため、彼らの権利を保護し完全な機密性を維持することが重要であるため、これは重要である。 機密性を維持するために、研究に参加する資格のある参加者によって同意書が署名される。 同意書には、研究の概要、収集される参加者情報、および収集される生物学的サンプルが含まれる。