Effetti dei Gallotannini sul Microbioma Intestinale e su Come Influisce sui Marcatori Infiammatori tra gli Individui Obesi.

Introduzione Contesto L'obesità è una malattia cronica grave, comune e costosa e, secondo un rapporto del Centro per il Controllo e la Prevenzione delle Malattie, più di 2 adulti su 5 negli Stati Uniti (USA) convivono con l'obesità. Il problema dell'obesità negli USA è una tendenza in aumento, poiché i rapporti hanno mostrato che la prevalenza dell'obesità tra gli adulti statunitensi di età pari o superiore a 20 anni dal 2017 al 2020 era del 41,9%, in aumento rispetto al 30,5% del 2000. Contemporaneamente, la prevalenza dell'obesità grave è aumentata dal 4,7% al 9,2%. Ciò significa che oltre 100 milioni di adulti negli USA convivono con l'obesità, mentre più di 22 milioni di persone convivono con l'obesità grave.

La causa principale dell'obesità è l'accumulo anormale ed eccessivo di lipidi in molti organi e tessuti, specialmente nell'area viscerale o addominale, incluso il tessuto adiposo bianco (WAT), definito obesità addominale. Numerose importanti malattie non trasmissibili, come il diabete mellito, la malattia del fegato grasso associata a disfunzione metabolica (MAFLD), le malattie cardiovascolari, l'ipertensione e i disturbi renali, sono significativamente influenzate da questo tipo di obesità. Uno dei principali meccanismi patogeni nell'obesità è stato proposto essere l'adipogenesi compromessa, ovvero il processo di differenziazione degli adipociti.

L'aumento dello stress ossidativo e dell'infiammazione sono ulteriori caratteristiche del rimodellamento malsano del WAT. Le strutture istologiche a corona (CLSs) si formano quando gli adipociti ingrossati rilasciano chemochine che attraggono cellule immunitarie, principalmente macrofagi, a circondare gli adipociti. Innescando regolatori pro-infiammatori come il fattore nucleare kappa B (NF-κB), che a sua volta aumenta la produzione di geni infiammatori e sovrasta i regolatori anti-infiammatori come l'interleuchina 10 (IL10), questo meccanismo intensifica lo stato iperinfiammatorio. Inoltre, lo stress ossidativo indotto da specie reattive dell'ossigeno (ROS) può sovrastare la regolazione antiossidante, in particolare l'espressione mediata dal fattore nucleare eritroide 2 correlato 2 (NFE2L2/NRF2) dei geni antiossidanti.

Problemi metabolici, come la resistenza all'insulina, la dislipidemia e l'adipogenesi disturbata, sono causati sia dallo stress ossidativo che dall'infiammazione. Pertanto, metodi per evitare l'ipertrofia degli adipociti, migliorare l'adipogenesi per creare adipociti normali, invertire il rimodellamento dannoso del WAT e limitare lo stress ossidativo e l'infiammazione potrebbero essere modi efficaci per combattere l'obesità e la sindrome metabolica.

L'uso dell'intervento dietetico per la prevenzione e la gestione dell'obesità è stato utilizzato per molti anni ed è stato descritto dai ricercatori come fondamentale. Consumare pasti o prodotti naturali, inclusi frutta e verdura, a bassa densità energetica e ricchi di sostanze bioattive è stato suggerito come un modo per gestire l'obesità e i problemi associati. Frutti e verdure selvatici commestibili da diverse aree sono noti per contenere una varietà di sostanze bioattive, inclusi fenoli, che possono avere effetti antinfiammatori, antiossidanti e di regolazione metabolica. Estratti di frutta che contengono flavonoidi e polifenoli, come la quercetina, la catechina e la rutina, hanno dimostrato benefici positivi sui marcatori di disfunzione metabolica. In modelli animali di obesità, includono diminuzioni negli adipociti e macrofagi, accumulo di lipidi, tessuto adiposo viscerale e marcatori di infiammazione e stress ossidativo.

L'alta concentrazione di sostanze fenoliche (come acido gallico, gallotannino, glicosidi galloili e flavonoidi) nei mango (Mangifera indica L.) suggerisce che abbiano un forte potenziale antiossidante e antinfiammatorio, indicando che i polifenoli derivati dai mango possono aiutare nella prevenzione delle malattie croniche legate all'obesità. Il consumo di mango ha diminuito l'obesità e migliorato i profili lipidici, la tolleranza al glucosio e le espressioni di citochine infiammatorie in ratti sottoposti a una dieta ad alto contenuto di grassi nella ricerca preclinica. La riduzione della crescita clonale mitotica, una fase cruciale nell'inizio della differenziazione degli adipociti, è molto probabilmente collegata all'inibizione dell'adipogenesi da parte degli estratti di mango, secondo un modello in vitro che utilizza cellule preadipocitarie 3T3-L1.

Indagini cliniche umane hanno anche mostrato che l'integrazione di mango abbassa la glicemia nelle persone obese, nei soggetti con diabete di tipo 2 e i profili lipidici e la capacità antiossidante negli adulti sani. Nelle persone sovrappeso con iperglicemia, i fitochimici naturali dei frutti di mango e i loro metaboliti, come la mangiferina, hanno dimostrato di aumentare i livelli di HDL e abbassare i livelli di trigliceridi e acidi grassi liberi. Secondo questi risultati, i polifenoli estratti dai mango hanno forti proprietà antinfiammatorie e anti-lipogeniche che possono aiutare a prevenire i disturbi cronici legati all'obesità.

Dichiarazione del problema Globalmente, l'obesità è diventata un'epidemia di problemi metabolici complessi e multivariati che stanno causando un aumento della prevalenza di condizioni croniche come il diabete di tipo 2, le malattie cardiache e diversi tipi di cancro. Un'ecologia microbica intestinale alterata, o disbiosi, e uno stato infiammatorio cronico di basso grado sono componenti chiave della fisiopatologia dell'obesità. Popolazioni ridotte di batteri benefici che producono acidi grassi a catena corta (SCFA), un aumento dei taxa pro-infiammatori e una diminuzione della diversità microbica sono caratteristiche comuni di questa condizione disbiotica, che possono tutti contribuire al mantenimento della disfunzione metabolica e dell'infiammazione sistemica. Per ridurre l'infiammazione e ripristinare l'equilibrio microbico nelle persone obese, c'è un crescente interesse nel creare interventi dietetici.

I polifenoli sono ben noti per le loro proprietà antinfiammatorie, antiossidanti e prebiotiche, in particolare i gallotannini (GT), presenti nei mango. Dopo essere stati scomposti dai microrganismi intestinali, i GT possono promuovere la crescita di batteri buoni e inibire la crescita di quelli cattivi, tuttavia gli effetti esatti possono dipendere dalla composizione del microbiota di ogni individuo. Allo stesso modo, il Lactiplantibacillus pentosus migliora l'integrità della mucosa intestinale e modula la funzione immunitaria, sebbene i suoi effetti in isolamento siano spesso incoerenti.

Lactiplantibacillus pentosus LPG1 (da qui indicato come LPG1) è un fermento derivato da biofilm di olive da tavola che ha dimostrato proprietà probiotiche in indagini in vitro e in vivo (modello murino). Questo ceppo possiede proprietà antinfiammatorie e fitasiche, può abbassare i livelli di colesterolo, inibisce le infezioni trasmesse dagli alimenti, si attacca alle cellule Caco-2 e non ha attività emolitica, tra le altre caratteristiche. Inoltre, indagini cliniche hanno dimostrato la sua sicurezza nelle persone. A questo proposito, uno studio recente ha scoperto che il genoma di L. pentosus LPG1 manca di geni di resistenza agli antibiotici e di virulenza mentre contiene numerosi possibili batteri benefici, batteriocine, geni del cluster di produzione di esopolisaccaridi e folati ed enzimi digestivi in grado di scomporre carboidrati complessi come galattosio, glicogeno, amido, cellulosa o xilano.

La capacità probiotica dei ceppi di Lactiplantibacillus è già stata studiata in studi clinici umani. Kotani ha investigato la capacità di L. pentosus b240, originariamente isolato da foglie di tè fermentate, di stimolare la secrezione di immunoglobulina A salivare negli anziani. Wang ha studiato l'impatto dell'ingestione orale di Lactiplantibacillus pentosus Lp-8 sulla composizione del microbiota fecale. de Vos ha studiato gli effetti dell'ingestione orale di diversi ceppi di L. pentosus sulla risposta immunologica, mentre Rudzki ha investigato l'effetto dell'ingestione orale di L. pentosus 299 sulle capacità cognitive nei pazienti depressi. Recentemente, Ahn ha investigato gli effetti di un ceppo di L. pentosus isolato dal kimchi, su bambini con dermatite atopica sensibile agli allergeni e ha mostrato sintomi migliorati nei partecipanti.

Sebbene non sia stato esplorato empiricamente nelle persone obese, la possibilità di una regolazione sinergica dei metaboliti ottenuti dai microrganismi o l'attenuazione degli indicatori infiammatori è particolarmente intrigante. Valutando gli effetti dell'estratto di GT, con o senza integrazione di L. pentosus, sul microbiota intestinale e sull'infiammazione negli adulti obesi in vitro, questo studio pilota mira a colmare questa lacuna. I risultati guideranno approcci futuri nella nutrizione personalizzata e nella gestione dell'obesità facendo luce sul fatto che le combinazioni polifenolo-probiotico possano fornire più vantaggi per la salute rispetto alla terapia a singolo agente.

Significato dello studio L'infiammazione cronica di basso grado e l'ecologia microbica intestinale disturbata sono ora comprese come fattori chiave nello sviluppo e nella progressione dell'obesità e delle malattie metaboliche correlate. Il progresso degli sforzi di prevenzione e trattamento dell'obesità dipende dalla gestione efficace di queste disfunzioni interconnesse. Un frutto tropicale popolare, i mango (Mangifera indica L.) sono particolarmente ricchi di gallotannini (GT), una sottoclasse di polifenoli idrolizzabili che hanno dimostrato di avere proprietà antinfiammatorie, antiossidanti, di regolazione metabolica e prebiotiche. Tuttavia, la biotrasformazione dei GT in metaboliti assorbibili e promotori della salute da parte dei microbi intestinali è un fattore importante nella loro bioattività. I potenziali vantaggi dei polifenoli generati dai mango non sono costantemente raggiunti tra le popolazioni perché la composizione microbica differisce tra gli individui.

L'integrazione con il probiotico ben caratterizzato Lactiplantibacillus pentosus presenta un modo praticabile per affrontare l'eterogeneità nel metabolismo dei polifenoli. Questo probiotico può aiutare a scomporre sostanze chimiche fenoliche complesse come i GT, migliorare l'integrità della barriera intestinale e regolare le risposte immunologiche. L. pentosus può lavorare in tandem con i GT per aumentare la biodisponibilità di metaboliti vantaggiosi e avere un buon impatto sull'ecologia microbica intestinale. Questo potrebbe poi intensificare gli effetti termogenici e antinfiammatori, che potrebbero manifestarsi come migliore salute intestinale, livelli più bassi di biomarcatori infiammatori e profili metabolici migliorati, specialmente nelle persone obese.

Questa scoperta ha importanti ramificazioni per una serie di campi. Valutando un approccio combinato polifenolo-probiotico progettato per alterare il metabolismo dell'ospite attraverso il microbiota intestinale, la scienza della nutrizione avanza il crescente campo degli alimenti funzionali e dei nutraceutici. Fornisce informazioni per supportare terapie dietetiche individualizzate per l'obesità basate sulla composizione microbica e sulla risposta metabolica individuale, il che è coerente con i principi della nutrizione di precisione. Dal punto di vista della salute pubblica, i risultati possono aiutare a sviluppare metodi scalabili basati sul cibo per ridurre il rischio di malattie croniche in gruppi suscettibili. L'obesità rimane un fattore di rischio significativo per le malattie cardiovascolari, il diabete di tipo 2 e alcuni tipi di cancro. Pertanto, trovare interventi dietetici derivati naturalmente, culturalmente accettati e facilmente accessibili che migliorino i risultati metabolici e infiammatori può essere un modo economico per prevenire e controllare le malattie, specialmente in ambienti svantaggiati.

Per la ricerca sulle malattie croniche, il lavoro fornisce intuizioni meccanicistiche sul ruolo dei polifenoli dietetici e dei probiotici nell'influenzare l'infiammazione sistemica e la disfunzione metabolica. Potrebbe aiutare a guidare futuri studi clinici mirati a incorporare trattamenti mirati al microbioma nei modelli di cura standard per l'obesità e altre malattie non trasmissibili. Lo studio ha anche implicazioni per le industrie della frutta e dell'agricoltura, in particolare nel promuovere le proprietà funzionali dei mango e di altri frutti ricchi di polifenoli. Se avrà successo, questo studio aumenterà la commercializzabilità dei mango come alimento promotore della salute, guiderà la domanda e incoraggerà lo sviluppo di prodotti alimentari arricchiti con polifenoli. Inoltre, i risultati possono informare le pratiche agricole mirate ad aumentare il contenuto di composti bioattivi nelle colture di frutta.

Oltre ai mango, questo studio getta le basi per investigare interazioni comparabili in altri frutti ricchi di polifenoli, come la sommacco, ampliando la rilevanza dello studio a diverse situazioni dietetiche culturali e geografiche. Nel campo della ricerca sul microbioma, questo studio avanza la nostra comprensione di come i composti bioattivi dietetici interagiscono con specifici taxa microbici per produrre metaboliti funzionali che influenzano la salute dell'ospite. Approfondisce la nostra comprensione della diversità microbica, dei batteri produttori di SCFA e delle vie microbiche correlate all'infiammazione nelle persone obese. Infine, lo studio contribuisce agli obiettivi educativi e di apprendimento fornendo un esempio pratico di ricerca nutrizionale traslazionale. Combina nutrizione molecolare, microbiologia e scienze comportamentali, rendendolo un eccellente caso di studio per formare studenti e professionisti nelle scienze della salute pubblica e biomediche interdisciplinari. Promuove l'approccio di pensiero sistemico necessario per risolvere complesse preoccupazioni sanitarie utilizzando soluzioni integrative basate sul cibo.

Domande di ricerca

Per guidare questa indagine, lo studio si concentra sulla comprensione di come l'estratto di GT dal mango e l'integrazione di Lactiplantibacillus pentosus influenzino il microbiota intestinale e l'infiammazione negli individui obesi attraverso le seguenti domande:

• In che modo il trattamento con GT, con o senza L. pentosus, influenza la composizione microbica intestinale negli adulti con obesità?
• Qual è l'impatto dell'integrazione di GT e L. pentosus sui biomarcatori infiammatori negli individui obesi?
• La variazione genetica tra gli individui con obesità spiega il metabolismo dei gallotannini.
• La combinazione di GT e L. pentosus mostra effetti sinergici nel modulare specifici taxa microbici associati all'obesità e all'infiammazione rispetto a ciascun intervento da solo?

Ipotesi

1. Si prevede che ci sia una correlazione inversa tra l'indice di massa corporea (BMI) e la concentrazione plasmatica di GT e metaboliti, così come le attività termogeniche e antinfiammatorie.
2. Si prevede che L. pentosus aumenti gli effetti benefici dei gallotannini

Obiettivo e Obiettivi Obiettivo Principale L'obiettivo primario di questo studio pilota è investigare gli effetti dei gallotannini (GT) dal mango, con o senza integrazione del probiotico L. pentosus, sulla composizione del microbiota intestinale e sui marcatori infiammatori negli individui obesi in vitro.

Obiettivi Specifici

1. Valutare i cambiamenti nella composizione del microbiota intestinale nei partecipanti obesi dopo il trattamento con estratto di GT, con o senza integrazione di L. pentosus.
2. Valutare il potenziale antinfiammatorio di GT e L. pentosus individualmente e in combinazione.
3. Identificare potenziali effetti sinergici tra GT e L. pentosus confrontando la diversità microbica, l'abbondanza di batteri produttori di SCFA e i cambiamenti nei marcatori infiammatori tra i gruppi di intervento.

Giustificazione L'ecologia microbica intestinale disturbata e l'infiammazione cronica di basso grado sono strettamente associate all'obesità ed entrambe hanno un ruolo nello sviluppo e nella progressione dei disturbi metabolici. Per gestire efficacemente l'obesità, è imperativo affrontare queste anomalie metaboliche interconnesse. I mango sono una ricca fonte di gallotannini (GT), che hanno dimostrato di avere qualità antinfiammatorie, di regolazione metabolica e prebiotiche. Tuttavia, la capacità dell'ospite di convertirli in derivati bioattivi - una capacità che varia secondo la composizione del microbiota intestinale - è cruciale per i loro vantaggi per la salute.

L'integrazione probiotica con Lactiplantibacillus pentosus presenta un forte approccio per superare questo vincolo metabolico. Migliorando la funzione della barriera mucosa, regolando le risposte immunologiche e forse aiutando nel metabolismo dei polifenoli, L. pentosus ha mostrato promesse nel promuovere la salute intestinale. Pertanto, combinare questo probiotico con il mango ricco di GT può aumentare l'esposizione sistemica a metaboliti di GT vantaggiosi. Come osservato nei campioni di plasma e tessuto adiposo, l'azione combinata della regolazione microbica e della biodisponibilità migliorata dei metaboliti può produrre effetti termogenici e antinfiammatori più evidenti, specialmente nelle persone obese.

Nonostante i vantaggi previsti, è importante riconoscere che qualsiasi cambiamento nell'infiammazione o nel metabolismo osservato dopo l'assunzione di integratori di L. pentosus potrebbe non essere dovuto esclusivamente a livelli elevati di metaboliti di GT. Il probiotico stesso può avere effetti biologici propri, come modificare il sistema immunitario dell'ospite o competere direttamente con batteri che causano infiammazione. Pertanto, lo scopo di questo studio è investigare le interazioni funzionali tra l'integrazione probiotica e i pasti ricchi di GT in un ambiente pratico e integrativo piuttosto che identificare vie specifiche dei GT.

Considerando il crescente interesse nelle terapie mirate al microbioma intestinale e nella nutrizione personalizzata, questo studio è sia necessario che tempestivo. Offrirà informazioni fondamentali sui modi in cui le interazioni tra polifenoli e probiotici influenzano importanti marcatori metabolici e infiammatori nei gruppi più a rischio per malattie croniche. Alla fine, i risultati potrebbero influenzare le raccomandazioni dietetiche e i piani di integrazione progettati per migliorare i risultati di salute nelle persone obese utilizzando tecniche consapevoli del microbioma.

Metodologia Disegno dello Studio Questo studio è uno studio clinico umano. Il disegno dello studio è randomizzato, in doppio cieco, controllato con placebo. Ai partecipanti verrà chiesto di fornire campioni umani come saliva, sangue e feci. Lo studio è stato approvato dagli Institutional Review Boards (IRB) della Prairie View A&M University (PVAMU) e della Texas A&M University e sarà registrato su www.Clinicaltrials.gov.

Popolazione dello Studio Un totale di 20 volontari sarà reclutato per questo studio, con 15 persone che convivono con l'obesità come parte del gruppo di intervento, mentre 5 individui magri e sani formeranno parte del gruppo di controllo. Per il gruppo di intervento, i 15 volontari saranno randomizzati in 3 gruppi, con n=5 partecipanti per gruppo. Il reclutamento sarà effettuato condividendo volantini di reclutamento in aree chiave come negozi di alimentari, supermercati, chiese, centri comunitari e altri centri eventi nella Contea di Waller e altre contee circostanti. Ai partecipanti verranno poste domande di screening prima di reclutarli nello studio.

Strumenti Una gamma di strumenti sarà utilizzata per garantire una raccolta e analisi dei dati accurata. Le cellule buccali saranno raccolte con tamponi buccali Isohelix SK-1 DNA e i campioni biologici (plasma, urina e feci) saranno conservati a -80°C in condizioni appropriate. I biomarcatori infiammatori e metabolici saranno misurati utilizzando un saggio multiplex basato su perle con analisi sul sistema Luminex L200 e software xPONENT. Il genotipaggio sarà condotto con saggi TaqMan per rilevare varianti SNP selezionate. La profilazione del microbioma sarà eseguita mediante estrazione del DNA con il kit Qiagen QIAamp DNA Stool Mini Kit, sequenziamento su piattaforme Illumina (MiSeq o NovaSeq) e analisi con QIIME2, database SILVA/Greengenes, LEfSe e PICRUSt2. L'analisi chimica dei metaboliti dei gallotannini sarà effettuata utilizzando HPLC-ESI-MSn su un triplo quadrupolo Thermo Finnigan Altis e trappola ionica ad alta risoluzione HPLC-MS. Infine, i saggi immunitari ex vivo coinvolgeranno la stimolazione delle cellule mononucleate del sangue periferico con LPS e i livelli di citochine saranno quantificati con il saggio multiplex xMAP.

Raccolta dei Campioni I campioni di plasma saranno raccolti al basale, settimana 1 dopo un digiuno notturno. Aliquote di plasma saranno preparate immediatamente dopo l'ottenimento e conservate a -80°C fino all'analisi. Le feci saranno raccolte quando disponibili e immediatamente trattate anaerobicamente. I partecipanti raccoglieranno campioni di cellule buccali al basale utilizzando tamponi buccali Isohelix SK-1 DNA e capsule essiccate Isohelix.

Analisi dei Campioni Marcatori infiammatori e metabolici I campioni di plasma sanguigno saranno analizzati per valutare i livelli di vari biomarcatori infiammatori. Questi includeranno citochine infiammatorie come l'interleuchina-10 (IL-10), la proteina chemoattrattante dei monociti-1 (MCP-1); e il marcatore cardiovascolare proteina C-reattiva (CRP). Tutte le misurazioni saranno eseguite utilizzando un saggio multiplex basato su perle (Millipore, Billerica, MA).

Genotipaggio Il DNA e i loci genotipizzati specifici saranno estratti utilizzando saggi di genotipizzazione TaqMan per fornire punteggi bi-allelici di polimorfismi a singolo nucleotide per i seguenti geni: associato alla massa grassa e all'obesità [FTO (rs9939609)] e desaturasi degli acidi grassi 1 [FADS1 (rs174546)].

Saggio del Microbioma Il DNA microbico sarà estratto dai campioni di feci utilizzando il kit Qiagen QIAamp DNA Stool Mini Kit. Il sequenziamento del gene 16S rRNA (regione V3-V4) sarà condotto utilizzando la piattaforma Illumina MiSeq. Per un'analisi più approfondita, sarà considerato il sequenziamento metagenomico shotgun utilizzando la piattaforma Illumina NovaSeq. I dati di sequenza saranno elaborati utilizzando Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME)2. La classificazione tassonomica utilizzerà i database SILVA o Greengenes.

Indici di diversità:

• La diversità alfa sarà calcolata utilizzando gli indici di Shannon e Chao1.
• La diversità beta sarà valutata utilizzando le distanze di Bray-Curtis e UniFrac.

L'analisi dell'abbondanza differenziale sarà eseguita utilizzando LEfSe e le funzioni microbiche previste saranno dedotte tramite Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt2) utilizzando R studio.

Analisi Chimica I metaboliti dei GT saranno isolati prima centrifugando per rimuovere la biomassa e poi estratti con acetato di etile utilizzando gallato di etile come standard interno. I parametri MS saranno ottimizzati utilizzando standard dei metaboliti previsti quando disponibili per l'identificazione dei frammenti padre/figlia con la massima intensità. I metaboliti target saranno quantificati utilizzando scansione completa, SRM (ione singolo) e MRM (monitoraggio di reazione multipla) su un HPLC-ESI-MSn utilizzando un triplo quadrupolo Thermo Finnigan Thermo Finnigan Altis utilizzando standard interni. I metaboliti non target o a bassa concentrazione saranno identificati/quantificati nel laboratorio di metabolomica della Texas A&M utilizzando una trappola ionica ad alta risoluzione HPLC-MS

Analisi Statistica Tutti i test statistici saranno eseguiti al livello 0.05 e saranno bilaterali. I dati saranno esaminati per la normalità e tutte le variabili non normali saranno trasformate log10. L'analisi sarà effettuata sulla base dell'intention to treat (ITT). Tecnica ANOVA per disegni crossover e, se necessario, integrata dall'equivalente test dei ranghi di Wilcoxon. Il cambiamento assoluto dal basale sarà testato e analisi secondarie saranno eseguite basate sulla percentuale di cambiamento dal basale. L'esito primario è il cambiamento nei biomarcatori infiammatori nel plasma, poiché questo esito si applica a individui magri e obesi. Tutti gli altri esiti investigati saranno trattati come esiti secondari. Ulteriori analisi secondarie degli effetti del trattamento utilizzeranno l'Analisi della Covarianza basata sulle caratteristiche basali del paziente. Assegneremo metà dei pazienti a caso a ciascuna delle due sequenze di trattamento per mantenere un disegno sperimentale bilanciato. La randomizzazione a blocchi sarà con numeri di blocco misti per proteggere la randomizzazione e l'equilibrio nell'assegnazione del trattamento, eliminare possibili bias e preservare il cieco. Ogni blocco consisterà di un individuo.

Considerazioni Etiche L'approvazione etica è stata richiesta e approvata dall'Institutional Review Board (IRB) della Texas A&M University e della Prairie A&M University prima di procedere con il reclutamento e la raccolta dei dati. Questo è importante poiché questo studio coinvolge soggetti umani ed è importante proteggere i loro diritti e mantenere la totale riservatezza. Per mantenere la riservatezza, un modulo di consenso sarà firmato dai partecipanti che si qualificano per partecipare allo studio. Il modulo di consenso conterrà la panoramica dello studio, le informazioni del partecipante che saranno raccolte e i campioni biologici da raccogliere.