Vliv gallotaninů na střevní mikrobiom a jejich dopad na zánětlivé markery u obézních jedinců.

Úvod Pozadí Obezita je závažné, běžné a nákladné chronické onemocnění a podle zprávy Centra pro kontrolu a prevenci nemocí žije s obezitou více než 2 z 5 dospělých ve Spojených státech amerických (USA). Problém obezity v USA má rostoucí trend, jak ukázaly zprávy, že prevalence obezity mezi americkými dospělými ve věku 20 let a staršími v letech 2017 až 2020 byla 41,9 %, což je nárůst z 30,5 % v roce 2000. Současně se prevalence těžké obezity zvýšila z 4,7 % na 9,2 %. To znamená, že více než 100 milionů dospělých v USA žije s obezitou, zatímco více než 22 milionů lidí žije s těžkou obezitou.

Hlavní příčinou obezity je abnormální a nadměrné hromadění lipidů v mnoha orgánech a tkáních, zejména v oblasti viscerální nebo břišní, včetně bílé tukové tkáně (WAT), což se označuje jako abdominální obezita. Tento typ obezity významně ovlivňuje mnoho důležitých nepřenosných onemocnění, jako je diabetes mellitus, metabolická dysfunkce spojená s mastným onemocněním jater (MAFLD), kardiovaskulární onemocnění, hypertenze a renální poruchy. Jeden z hlavních patogenních mechanismů u obezity byl navržen jako narušená adipogeneze neboli proces diferenciace adipocytů.

Zvýšený oxidační stres a zánět jsou další charakteristiky nezdravého remodelování WAT. Histologické korunovité struktury (CLSs) se tvoří, když zvětšené adipocyty uvolňují chemokiny, které přitahují imunitní buňky, zejména makrofágy, aby obklopily adipocyty. Tím, že tento mechanismus spouští prozánětlivé regulátory jako jaderný faktor-kappa B (NF-κB), což zase posiluje produkci zánětlivých genů a převyšuje protizánětlivé regulátory jako interleukin 10 (IL10), tento mechanismus zesiluje hyperzánětlivý stav. Dále oxidační stres vyvolaný reaktivními formami kyslíku (ROS) může převážit antioxidační regulaci, zejména expresi antioxidačních genů zprostředkovanou jaderným faktorem erytroid 2-souvisejícím faktorem 2 (NFE2L2/NRF2).

Metabolické problémy, jako je inzulinová rezistence, dyslipidemie a narušená adipogeneze, jsou způsobeny jak oxidačním stresem, tak zánětem. Proto mohou být metody k zabránění hypertrofie adipocytů, zlepšení adipogeneze k vytvoření normálních adipocytů, zvrácení škodlivého remodelování WAT a omezení oxidačního stresu a zánětu účinnými způsoby boje proti obezitě a metabolickému syndromu.

Použití dietní intervence pro prevenci a léčbu obezity se používá již mnoho let a výzkumníci ji popsali jako základní. Konzumace jídel nebo přírodních produktů, včetně ovoce a zeleniny, které mají nízkou energetickou hustotu a vysoký obsah bioaktivních chemikálií, byla navržena jako způsob zvládání obezity a s ní spojených problémů. Je známo, že jedlé divoké plody a zelenina z různých oblastí obsahují řadu bioaktivních látek, včetně fenolických látek, které mohou mít protizánětlivé, antioxidační a metabolicky regulující účinky. Extrakt z ovoce obsahující flavonoidy a polyfenoly, jako je kvercetin, katechin a rutin, prokázal pozitivní účinky na markery metabolické dysfunkce. V animálních modelech obezity zahrnují snížení adipocytů a makrofágů, hromadění lipidů, viscerální tukové tkáně a markerů zánětu a oxidačního stresu.

Vysoká koncentrace fenolických látek (jako je kyselina gallová, gallotanin, galloyl glykosidy a flavonoidy) v mangu (Mangifera indica L.) naznačuje, že mají silný antioxidační a protizánětlivý potenciál, což ukazuje, že polyfenoly získané z manga mohou pomoci při prevenci chronických onemocnění spojených s obezitou. Konzumace manga snížila obezitu a zlepšila lipidové profily, glukózovou toleranci a expresi zánětlivých cytokinů u potkanů krmených vysokotučnou dietou v preklinickém výzkumu. Snížení mitotického klonálního růstu, klíčové fáze při zahájení diferenciace adipocytů, je s největší pravděpodobností spojeno s inhibicí adipogeneze extrakty manga, podle in vitro modelu používajícího 3T3-L1 preadipocytární buňky.

Lidské klinické studie také ukázaly, že suplementace mangem snižuje hladinu glukózy v krvi u obézních lidí, u jedinců s diabetem 2. typu a u zdravých dospělých lipidové profily a antioxidační kapacitu. U lidí s nadváhou a hyperglykémií bylo prokázáno, že přírodní fytochemikálie z plodů manga a jejich metabolity, jako je mangiferin, zvyšují hladinu HDL a snižují hladinu triglyceridů a volných mastných kyselin. Podle těchto výsledků mají polyfenoly extrahované z manga silné protizánětlivé a anti-lipogenní vlastnosti, které mohou pomoci předcházet chronickým poruchám spojeným s obezitou.

Problémové vyjádření Celosvětově se obezita stala epidemií komplikovaných, multivariačních metabolických problémů, které způsobují zvýšení prevalence chronických stavů, jako je diabetes 2. typu, srdeční onemocnění a několik typů rakoviny. Alterovaná střevní mikrobiální ekologie neboli dysbióza a přetrvávající nízkostupňový zánětlivý stav jsou klíčovými složkami patofyziologie obezity. Snížené populace prospěšných bakterií produkujících mastné kyseliny s krátkým řetězcem (SCFAs), nárůst prozánětlivých taxonů a pokles mikrobiální diverzity jsou běžnými charakteristikami tohoto dysbiotického stavu, což může přispět k udržení metabolické dysfunkce a systémového zánětu. Ke snížení zánětu a obnovení mikrobiální rovnováhy u obézních lidí roste zájem o vytváření dietních intervencí.

Polyfenoly jsou dobře známé svými protizánětlivými, antioxidačními a prebiotickými vlastnostmi, zejména gallotaniny (GTs), které jsou přítomny v mangu. Po rozkladu střevními mikroorganismy mohou GTs podporovat růst dobrých bakterií a inhibovat růst špatných, nicméně přesné účinky mohou záviset na složení mikrobiomu každého jedince. Podobně Lactiplantibacillus pentosus zlepšuje integritu střevní sliznice a moduluje imunitní funkci, ačkoli jeho účinky v izolaci jsou často nekonzistentní.

Lactiplantibacillus pentosus LPG1 (dále označovaný jako LPG1) je fermentát odvozený z biofilmů stolních oliv, který prokázal probiotické vlastnosti ve studiích in vitro a in vivo (myší model). Tento kmen má protizánětlivé a fytázové vlastnosti, může snižovat hladinu cholesterolu, inhibuje infekce přenášené potravinami, přichytává se k buňkám Caco-2 a nemá hemolytickou aktivitu, mimo jiné vlastnosti. Navíc klinické studie prokázaly jeho bezpečnost u lidí. V tomto ohledu nedávná studie zjistila, že genom L. pentosus LPG1 postrádá geny rezistence na antibiotika a virulence, zatímco obsahuje četné možné prospěšné bakterie, baktericiny, exopolysacharidy, geny klastru produkce folátu a trávicí enzymy schopné rozkládat komplexní sacharidy, jako je galaktóza, glykogen, škrob, celulóza nebo xylan.

Probiotická schopnost kmenů Lactiplantibacillus již byla studována v lidských klinických studiích. Kotani zkoumal schopnost L. pentosus b240, původně izolovaného z fermentovaných čajových listů, stimulovat sekreci slinného imunoglobulinu A u starších osob. Wang zkoumal vliv perorálního příjmu Lactiplantibacillus pentosus Lp-8 na složení fekální mikroflóry. de Vos studoval účinky perorálního příjmu několika kmenů L. pentosus na imunitní odpověď, zatímco Rudzki zkoumal vliv perorálního L. pentosus 299 na kognitivní schopnosti u depresivních pacientů. Nedávno Ahn zkoumal účinky kmene L. pentosus izolovaného z kimchi na děti s alergen-senzitivní atopickou dermatitidou a ukázal zlepšení příznaků u účastníků.

Ačkoli to nebylo empiricky prozkoumáno u obézních lidí, možnost synergické regulace metabolitů získaných z mikroorganismů nebo zeslabení zánětlivých ukazatelů je obzvláště zajímavá. Tato pilotní studie má za cíl zaplnit tuto mezeru hodnocením účinků extraktu GT, s nebo bez suplementace L. pentosus, na střevní mikroflóru a zánět u obézních dospělých in vitro. Výsledky povedou budoucí přístupy v personalizované výživě a léčbě obezity tím, že osvětlí, zda kombinace polyfenol-probiotikum mohou poskytnout více zdravotních výhod než jednosložková terapie.

Význam studie Chronický nízkostupňový zánět a narušená střevní mikrobiální ekologie jsou nyní chápány jako klíčové faktory ve vývoji a progresi obezity a souvisejících metabolických onemocnění. Pokrok v úsilí o prevenci a léčbu obezity závisí na účinném zvládání těchto propojených dysfunkcí. Oblíbené tropické ovoce, mango (Mangifera indica L.), je obzvláště bohaté na gallotaniny (GTs), podtřídu hydrolyzovatelných polyfenolů, u kterých bylo prokázáno, že mají protizánětlivé, antioxidační, metabolicky regulující a prebiotické vlastnosti. Nicméně biotransformace GTs na vstřebatelné, zdraví podporující metabolity střevními mikroby je hlavním faktorem jejich bioaktivity. Potenciální výhody polyfenolů získaných z manga nejsou konzistentně dosahovány napříč populacemi, protože mikrobiální složení se liší mezi jednotlivci.

Suplementace dobře charakterizovaným probiotikem Lactiplantibacillus pentosus představuje životaschopný způsob, jak řešit heterogenitu v metabolismu polyfenolů. Toto probiotikum může pomoci rozložit komplexní fenolické chemikálie jako GTs, zlepšit integritu střevní bariéry a regulovat imunitní odpovědi. L. pentosus může pracovat v tandemu s GTs ke zvýšení biologické dostupnosti výhodných metabolitů a mít dobrý dopad na střevní mikrobiální ekologii. To by pak mohlo zesílit termogenní a protizánětlivé účinky, které by se mohly projevit jako lepší zdraví střev, nižší hladiny zánětlivých biomarkerů a zlepšené metabolické profily, zejména u obézních lidí.

Tento objev má důležité důsledky pro řadu oblastí. Hodnocením kombinovaného přístupu polyfenol-probiotikum navrženého k ovlivnění metabolismu hostitele prostřednictvím střevní mikroflóry výživová věda posouvá rostoucí oblast funkčních potravin a nutraceutik. Poskytuje informace na podporu individualizovaných dietních terapií pro obezitu založených na mikrobiálním složení a individuální metabolické odpovědi, což je v souladu se zásadami přesné výživy. Z pohledu veřejného zdraví mohou výsledky pomoci vyvinout potravinové, škálovatelné metody ke snížení rizika chronických onemocnění u náchylných skupin. Obezita zůstává významným rizikovým faktorem pro kardiovaskulární onemocnění, diabetes 2. typu a některé typy rakoviny. Proto nalezení přirozeně odvozených, kulturně přijatelných a snadno dostupných dietních intervencí, které zlepšují metabolické a zánětlivé výsledky, může být ekonomickým způsobem prevence a kontroly onemocnění, zejména v znevýhodněných prostředích.

Pro výzkum chronických onemocnění práce poskytuje mechanistické poznatky o roli dietních polyfenolů a probiotik v ovlivňování systémového zánětu a metabolické dysfunkce. Mohla by pomoci vést budoucí klinické studie zaměřené na začlenění mikrobiomem cílených léčeb do standardních modelů péče o obezitu a další nepřenosná onemocnění. Studie má také důsledky pro ovocnářský a zemědělský průmysl, zejména při propagaci funkčních vlastností manga a dalších plodů bohatých na polyfenoly. Pokud bude úspěšná, tato studie zvýší prodejnost manga jako zdraví podporující potraviny, pohne poptávkou a podpoří vývoj potravinových produktů obohacených o polyfenoly. Dále zjištění mohou informovat zemědělské postupy zaměřené na zvýšení obsahu bioaktivních sloučenin v ovocných plodinách.

Kromě manga tato studie položí základy pro zkoumání srovnatelných interakcí v jiných plodech bohatých na polyfenoly, jako je škumpa, čímž rozšíří relevanci studie na různé kulturní a geografické dietní situace. V oblasti výzkumu mikrobiomu tato studie rozšiřuje naše chápání toho, jak dietní bioaktivní sloučeniny interagují se specifickými mikrobiálními taxony k produkci funkčních metabolitů ovlivňujících zdraví hostitele. Prohlubuje naše porozumění mikrobiální diverzitě, bakteriím produkujícím SCFAs a zánětem souvisejícím mikrobiálním drahám u obézních lidí. Nakonec studie přispívá k vzdělávacím a učebním cílům tím, že poskytuje praktický příklad translančního výzkumu výživy. Kombinuje molekulární výživu, mikrobiologii a behaviorální vědu, což z ní činí vynikající případovou studii pro školení studentů a praktiků v interdisciplinárním veřejném zdraví a biomedicínských vědách. Podporuje systémový přístup potřebný k řešení komplexních zdravotních problémů pomocí integrativních, potravinových řešení.

Výzkumné otázky

Pro vedení tohoto šetření se studie zaměřuje na porozumění tomu, jak extrakt GT z manga a suplementace Lactiplantibacillus pentosus ovlivňují střevní mikroflóru a zánět u obézních jedinců prostřednictvím následujících otázek:

• Jak léčba GTs, s nebo bez L. pentosus, ovlivňuje složení střevní mikroflóry u dospělých s obezitou?
• Jaký je dopad suplementace GT a L. pentosus na zánětlivé biomarkery u obézních jedinců?
• Zohledňuje genetická variabilita mezi jednotlivci s obezitou metabolismus gallotaninů.
• Projevuje kombinace GTs a L. pentosus synergické účinky v modulaci specifických mikrobiálních taxonů spojených s obezitou a zánětem ve srovnání s jednotlivými intervencemi samostatně?

Hypotéza

1. Očekává se, že existuje inverzní korelace mezi indexem tělesné hmotnosti (BMI) a plazmatickou koncentrací GTs a metabolitů, stejně jako termogenní a protizánětlivé aktivity.
2. Očekává se, že L. pentosus zvýší prospěšné účinky gallotaninů

Cíl a cíle Hlavní cíl Primárním cílem této pilotní studie je prozkoumat účinky gallotaninů (GTs) z manga, s nebo bez suplementace probiotikem L. pentosus, na složení střevní mikroflóry a zánětlivé markery u obézních jedinců in vitro.

Specifické cíle

1. Vyhodnotit změny ve složení střevní mikroflóry u obézních účastníků po léčbě extraktem GT, s nebo bez suplementace L. pentosus.
2. Posoudit protizánětlivý potenciál GTs a L. pentosus jednotlivě a v kombinaci.
3. Identifikovat potenciální synergické účinky mezi GTs a L. pentosus porovnáním mikrobiální diverzity, abundance bakterií produkujících SCFAs a změn zánětlivých markerů napříč intervenčními skupinami.

Odůvodnění Narušená střevní mikrobiální ekologie a chronický nízkostupňový zánět jsou úzce spojeny s obezitou a oba hrají roli ve vývoji a progresi metabolických poruch. Pro účinné zvládání obezity je nezbytné řešit tyto propojené metabolické abnormality. Mango je bohatým zdrojem gallotaninů (GTs), u kterých bylo prokázáno, že mají protizánětlivé, metabolicky regulující a prebiotické vlastnosti. Nicméně schopnost hostitele přeměnit je na bioaktivní deriváty – schopnost, která se liší podle složení střevní mikroflóry – je klíčová pro jejich zdravotní výhody.

Suplementace probiotikem Lactiplantibacillus pentosus představuje silný přístup k překonání tohoto metabolického omezení. Zlepšením funkce slizniční bariéry, regulací imunitních odpovědí a možná pomocí v metabolismu polyfenolů prokázal L. pentosus potenciál v podpoře zdraví střev. Proto kombinace tohoto probiotika s mangem bohatým na GT může zvýšit systémovou expozici výhodným metabolitům GT. Jak je vidět ve vzorcích plazmy a tukové tkáně, kombinovaná akce mikrobiální regulace a zvýšené biologické dostupnosti metabolitů může produkovat více patrných termogenních a protizánětlivých účinků, zejména u obézních lidí.

Navzdory očekávaným výhodám je důležité uznat, že jakékoli změny v zánětu nebo metabolismu pozorované po užívání doplňků L. pentosus nemusí být výhradně způsobeny zvýšenými hladinami metabolitů GT. Probiotikum samo o sobě může mít biologické účinky, jako je modifikace imunitního systému hostitele nebo přímá konkurence s bakteriemi způsobujícími zánět. Proto cílem této studie je prozkoumat funkční interakce mezi suplementací probiotik a potravinami bohatými na GT v praktickém, integrativním prostředí spíše než identifikovat specifické dráhy GT.

S ohledem na rostoucí zájem o terapie cílené na střevní mikrobiom a personalizovanou výživu je tato studie nezbytná a aktuální. Poskytne základní informace o způsobech, jak interakce mezi polyfenoly a probiotiky ovlivňují klíčové metabolické a zánětlivé markery ve skupinách nejvíce ohrožených chronickým onemocněním. Nakonec výsledky mohou ovlivnit dietní doporučení a plány doplňků navržené ke zlepšení zdravotních výsledků u obézních lidí pomocí technik vědomých mikrobiomu.

Metodologie Design studie Tato studie je lidská klinická studie. Design studie je randomizovaný, dvojitě zaslepený, placebem kontrolovaný. Účastníci budou požádáni o poskytnutí lidských vzorků, jako jsou sliny, krev a stolice. Studie byla schválena institucionálními revizními komisemi (IRB) Prairie View A&M University (PVAMU) a Texas A&M University a bude registrována na www.Clinicaltrials.gov.

Studijní populace Celkem bude pro tuto studii rekrutováno 20 dobrovolníků, přičemž 15 lidí žijících s obezitou bude tvořit intervenční skupinu, zatímco 5 štíhlých a zdravých jedinců bude tvořit kontrolní skupinu. Pro intervenční skupinu bude 15 dobrovolníků randomizováno do 3 skupin, s n=5 účastníky na skupinu. Nábor bude proveden sdílením náborových letáků na klíčových místech, jako jsou obchody s potravinami, supermarkety, kostely, komunitní centra a další eventová centra v okrese Waller a dalších okolních okresech. Účastníci budou před zařazením do studie dotazováni na screeningové otázky.

Přístroje K zajištění přesného sběru a analýzy dat bude použita řada přístrojů. Bukální buňky budou odebrány s Isohelix SK-1 DNA bukálními stěry a biologické vzorky (plazma, moč a stolice) budou skladovány při -80 °C za vhodných podmínek. Zánětlivé a metabolické biomarkery budou měřeny pomocí multiplexového bead-based assay s analýzou na systému Luminex L200 a softwarem xPONENT. Genotypování bude provedeno pomocí TaqMan assay k detekci vybraných SNP variant. Profilování mikrobiomu bude provedeno extrakcí DNA s Qiagen QIAamp DNA Stool Mini Kit, sekvenováním na platformách Illumina (MiSeq nebo NovaSeq) a analýzou s QIIME2, databázemi SILVA/Greengenes, LEfSe a PICRUSt2. Chemická analýza metabolitů gallotaninu bude provedena pomocí HPLC-ESI-MSn na Thermo Finnigan Altis triple quadrupole a HPLC-MS high-resolution ion trap. Nakonec ex vivo imunitní testy budou zahrnovat stimulaci periferních mononukleárních buněk LPS a hladiny cytokinů budou kvantifikovány pomocí xMAP Multiplex Assay.

Odběr vzorků Vzorky plazmy budou odebrány na začátku, týden 1 po nočním lačnění. Alikvoty plazmy budou připraveny ihned po získání a skladovány při -80 °C do analýzy. Stolice bude odebrána podle dostupnosti a okamžitě anaerobně ošetřena. Účastníci odeberou vzorky bukálních buněk na začátku pomocí Isohelix SK-1 DNA bukálních stěrů a Isohelix dried-capsules.

Analýza vzorků Zánětlivé a metabolické markery Vzorky krevní plazmy budou analyzovány k posouzení hladin různých zánětlivých biomarkerů. Ty budou zahrnovat zánětlivé cytokiny jako interleukin-10 (IL-10), monocytový chemoatraktantní protein-1 (MCP-1); a kardiovaskulární marker C-reaktivní protein (CRP). Všechna měření budou provedena pomocí multiplexového bead-based assay (Millipore, Billerica, MA).

Genotypování DNA a genotypované specifické lokusy budou extrahovány pomocí TaqMan genotypizačních assay k poskytnutí bi-allelického skóre jednoduchých nukleotidových polymorfismů pro následující geny: gen spojený s tělesnou hmotností a obezitou [FTO (rs9939609)] a mastná kyselina desaturáza 1 [FADS1 (rs174546)].

Mikrobiomový test Mikrobiální DNA bude extrahována ze vzorků stolice pomocí Qiagen QIAamp DNA Stool Mini Kit. Sekvenování genu 16S rRNA (oblast V3-V4) bude provedeno pomocí platformy Illumina MiSeq. Pro hlubší analýzu bude zvažováno shotgun metagenomické sekvenování pomocí platformy Illumina NovaSeq. Sekvenční data budou zpracována pomocí Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME)2. Taxonomická klasifikace využije databáze SILVA nebo Greengenes.

Indexy diverzity:

• Alfa diverzita bude vypočtena pomocí indexů Shannon a Chao1.
• Beta diverzita bude hodnocena pomocí vzdáleností Bray-Curtis a UniFrac.

Analýza diferenciální abundance bude provedena pomocí LEfSe a predikované mikrobiální funkce budou odvozeny prostřednictvím Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt2) pomocí R studia.

Chemická analýza Metabolity GT budou izolovány nejprve centrifugací k odstranění biomasy a poté extrahovány ethylacetátem s použitím ethylgallátu jako interního standardu. MS parametry budou optimalizovány pomocí standardů predikovaných metabolitů, pokud jsou dostupné pro identifikaci rodičovských/dceřiných fragmentů s nejvyšší intenzitou. Cílové metabolity budou kvantifikovány pomocí full scan, SRM (single ion) a MRM (multiple reaction monitoring) na HPLC-ESI-MSn pomocí Thermo Finnigan Thermo Finnigan Altis triple quadrupole s interními standardy. Neurčené metabolity nebo metabolity s nízkou koncentrací budou identifikovány/kvantifikovány v Texas A&M metabolomics core laboratory pomocí HPLC-MS high-resolution ion trap

Statistická analýza Veškeré statistické testování bude provedeno na hladině 0,05 a bude oboustranné. Data budou zkontrolována na normalitu a všechny nenormální proměnné budou log10 transformovány. Analýza bude provedena na základě záměru léčit (ITT). ANOVA technika pro křížové designy a podle potřeby doplněná ekvivalentním Wilcoxonovým pořadovým testem. Bude testována absolutní změna od výchozího stavu a sekundární analýzy budou provedeny na základě procentuální změny od výchozího stavu. Primárním výsledkem je změna v zánětlivých biomarkerech v plazmě, protože tento výsledek platí pro štíhlé i obézní jedince. Všechny ostatní zkoumané výsledky budou považovány za sekundární výsledky. Další sekundární analýza účinků léčby použije analýzu kovariance na základě charakteristik pacientů na začátku. Přiřadíme polovinu pacientů náhodně ke každé ze dvou léčebných sekvencí, abychom udrželi vyvážený experimentální design. Bloková randomizace bude jako smíšená čísla bloků k ochraně randomizace a rovnováhy v přidělení léčby, eliminaci možných zkreslení a zachování zaslepení. Každý blok bude sestávat z jednotlivce.

Etické aspekty Etické schválení bylo vyžádáno a schváleno institucionální revizní komisí (IRB) Texas A&M University a Prairie A&M University před pokračováním v náboru a sběru dat. To je důležité, protože tato studie zahrnuje lidské subjekty a je důležité chránit jejich práva a také udržovat naprostou důvěrnost. Pro udržení důvěrnosti bude účastníky, kteří se kvalifikují k účasti ve studii, podepsán informovaný souhlas. Informovaný souhlas bude obsahovat přehled studie, informace o účastnících, které budou shromažďovány, a biologické vzorky, které budou odebrány.