Efeitos dos Galotaninos no Microbioma Intestinal e Como Afeta os Marcadores Inflamatórios em Indivíduos Obesos.

Introdução Antecedentes A obesidade é uma doença crónica grave, comum e dispendiosa, e segundo um relatório do Centro de Controlo e Prevenção de Doenças, mais de 2 em cada 5 adultos nos Estados Unidos (EUA) vivem com obesidade. O problema da obesidade nos EUA é uma tendência crescente, pois relatórios mostraram que a prevalência de obesidade entre adultos norte-americanos com 20 anos ou mais de 2017 a 2020 foi de 41,9%, subindo de 30,5% em 2000. Simultaneamente, a prevalência de obesidade grave também aumentou de 4,7% para 9,2%. Isso significa que mais de 100 milhões de adultos nos EUA vivem com obesidade, enquanto mais de 22 milhões de pessoas vivem com obesidade grave.

A principal causa da obesidade é o acúmulo anormal e excessivo de lípidos em muitos órgãos e tecidos, especialmente na área visceral ou abdominal, incluindo tecido adiposo branco (TAB), a que se refere como obesidade abdominal. Numerosas doenças não transmissíveis importantes, como diabetes mellitus, doença hepática gordurosa associada à disfunção metabólica (DHGDM), doenças cardiovasculares, hipertensão e distúrbios renais, são significativamente influenciadas por este tipo de obesidade. Um dos principais mecanismos patogénicos na obesidade foi proposto como sendo a adipogénese prejudicada, ou o processo de diferenciação dos adipócitos.

O aumento do stress oxidativo e da inflamação são características adicionais da remodelação prejudicial do TAB. Estruturas histológicas semelhantes a coroas (CLSs) são formadas quando adipócitos aumentados libertam quimiocinas que atraem células imunes, principalmente macrófagos, para circundar os adipócitos. Ao desencadear reguladores pró-inflamatórios como o fator nuclear kappa B (NF-κB), que por sua vez aumenta a produção de genes inflamatórios e sobrepõe reguladores anti-inflamatórios como a interleucina 10 (IL10), este mecanismo intensifica o estado hiperinflamatório. Além disso, o stress oxidativo induzido por espécies reativas de oxigénio (ROS) pode sobrepor-se à regulação antioxidante, especialmente à expressão mediada pelo fator nuclear eritroide 2 relacionado com o fator 2 (NFE2L2/NRF2) de genes antioxidantes.

Problemas metabólicos, como resistência à insulina, dislipidemia e adipogénese perturbada, são causados tanto pelo stress oxidativo como pela inflamação. Portanto, métodos para evitar a hipertrofia dos adipócitos, melhorar a adipogénese para criar adipócitos normais, reverter a remodelação prejudicial do TAB e limitar o stress oxidativo e a inflamação podem ser formas eficazes de combater a obesidade e a síndrome metabólica.

A utilização de intervenção dietética para prevenção e gestão da obesidade tem sido usada durante muitos anos e tem sido descrita por investigadores como fundamental. Consumir refeições ou produtos naturais, incluindo frutas e vegetais, que são baixos em densidade energética e ricos em químicos bioativos tem sido sugerido como uma forma de gerir a obesidade e os seus problemas associados. Frutas e vegetais silvestres comestíveis de diferentes áreas são conhecidos por conterem uma variedade de substâncias bioativas, incluindo fenólicos, que podem ter efeitos anti-inflamatórios, antioxidantes e reguladores metabólicos. Extratos de frutas que contêm flavonoides e polifenóis, como a quercetina, catequina e rutina, demonstraram benefícios positivos em marcadores de disfunção metabólica. Em modelos animais de obesidade, eles incluem diminuições em adipócitos e macrófagos, acúmulo lipídico, tecido adiposo visceral e marcadores de inflamação e stress oxidativo.

A alta concentração de substâncias fenólicas (como ácido gálico, galotanino, glicosídeos galoil e flavonoides) nas mangas (Mangifera indica L.) sugere que elas têm forte potencial antioxidante e anti-inflamatório, indicando que os polifenóis produzidos a partir de mangas podem ajudar na prevenção de doenças crónicas ligadas à obesidade. O consumo de manga diminuiu a obesidade e melhorou os perfis lipídicos, a tolerância à glucose e as expressões de citocinas inflamatórias em ratos alimentados com uma dieta rica em gordura em pesquisa pré-clínica. A redução do crescimento clonal mitótico, uma fase crucial no início da diferenciação dos adipócitos, está muito provavelmente ligada à inibição da adipogénese por extratos de manga, de acordo com um modelo in vitro utilizando células pré-adipócitos 3T3-L1.

Investigações clínicas em humanos também mostraram que a suplementação com manga reduz a glucose no sangue em pessoas obesas, indivíduos com diabetes tipo 2, e os perfis lipídicos e capacidade antioxidante em adultos saudáveis. Em pessoas com excesso de peso com hiperglicemia, fitoquímicos naturais de frutos de manga e seus metabolitos, como a mangiferina, demonstraram aumentar os níveis de HDL e diminuir os níveis de triglicerídeos e ácidos gordos livres. De acordo com estes resultados, polifenóis extraídos de mangas têm fortes propriedades anti-inflamatórias e anti-lipogénicas que podem ajudar a prevenir distúrbios crónicos ligados à obesidade.

Declaração do problema Globalmente, a obesidade tornou-se uma epidemia de problemas metabólicos complexos e multivariados que estão a causar um aumento na prevalência de condições crónicas como diabetes tipo 2, doença cardíaca e vários tipos de cancro. Uma ecologia microbiana intestinal alterada, ou disbiose, e um estado inflamatório crónico de baixo grau são componentes-chave da fisiopatologia da obesidade. Populações reduzidas de bactérias benéficas que produzem ácidos gordos de cadeia curta (AGCC), um aumento em taxa pró-inflamatórias e uma diminuição na diversidade microbiana são características comuns desta condição disbiótica, que podem todos contribuir para a manutenção da disfunção metabólica e inflamação sistémica. Para reduzir a inflamação e restaurar o equilíbrio microbiano em pessoas obesas, há um interesse crescente em criar intervenções dietéticas.

Os polifenóis são bem conhecidos pelas suas propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes e pré-bióticas, especialmente os galotaninos (GTs), que estão presentes nas mangas. Após serem decompostos por microrganismos intestinais, os GTs podem promover o crescimento de bactérias boas e inibir o crescimento de bactérias más, no entanto os efeitos exatos podem depender da composição da microbiota de cada indivíduo. Da mesma forma, o Lactiplantibacillus pentosus melhora a integridade da mucosa intestinal e modula a função imunitária, embora os seus efeitos isoladamente sejam frequentemente inconsistentes.

Lactiplantibacillus pentosus LPG1 (doravante referido como LPG1) é um fermento derivado de biofilmes de azeitonas de mesa que demonstrou propriedades probióticas em investigações in vitro e in vivo (modelo murino). Esta estirpe possui propriedades anti-inflamatórias e fitase, pode baixar os níveis de colesterol, inibe infeções alimentares, adere a células Caco-2 e não tem atividade hemolítica, entre outras características. Além disso, investigações clínicas demonstraram a sua segurança em pessoas. Neste sentido, um estudo recente descobriu que o genoma de L. pentosus LPG1 carece de genes de resistência a antibióticos e virulência enquanto contém numerosas bactérias benéficas possíveis, bacteriocina, exopolissacarídeos, genes de cluster de produção de folato e enzimas digestivas capazes de decompor carboidratos complexos como galactose, glicogénio, amido, celulose ou xilano.

A capacidade probiótica de estirpes de Lactiplantibacillus já foi estudada em ensaios clínicos em humanos. Kotani investigou a capacidade de L. pentosus b240, originalmente isolado de folhas de chá fermentadas, de estimular a secreção de imunoglobulina A salivar em idosos. Wang investigou o impacto da ingestão oral de Lactiplantibacillus pentosus Lp-8 na composição da microbiota fecal. de Vos estudou os efeitos da ingestão oral de várias estirpes de L. pentosus na resposta imunológica, enquanto Rudzki investigou o efeito do L. pentosus 299 oral nas capacidades cognitivas em pacientes deprimidos. Recentemente, Ahn investigou os efeitos de uma estirpe de L. pentosus isolada de kimchi, em crianças com dermatite atópica sensível a alérgenos e mostrou sintomas melhorados nos participantes.

Embora não tenha sido explorado empiricamente em pessoas obesas, a possibilidade de regulação sinérgica de metabolitos obtidos de microrganismos ou atenuação de indicadores inflamatórios é particularmente intrigante. Ao avaliar os efeitos do extrato de GT, com ou sem suplementação de L. pentosus, na microbiota intestinal e inflamação em adultos obesos in vitro, este estudo piloto visa preencher esta lacuna. Os resultados orientarão abordagens futuras em nutrição personalizada e gestão da obesidade ao esclarecer se combinações polifenol-probiótico podem fornecer mais vantagens de saúde do que terapia de agente único.

Significância do estudo A inflamação crónica de baixo grau e a ecologia microbiana intestinal perturbada são agora entendidas como fatores-chave no desenvolvimento e progressão da obesidade e doenças metabólicas relacionadas. O avanço dos esforços de prevenção e tratamento da obesidade depende da gestão eficaz destas disfunções interligadas. Uma fruta tropical popular, as mangas (Mangifera indica L.) são particularmente ricas em galotaninos (GTs), uma subclasse de polifenóis hidrolisáveis que demonstraram ter propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes, reguladoras metabólicas e pré-bióticas. No entanto, a biotransformação de GTs em metabolitos absorvíveis e promotores de saúde por micróbios intestinais é um fator principal na sua bioatividade. As vantagens potenciais dos polifenóis gerados a partir de mangas não são consistentemente alcançadas entre populações porque a composição microbiana difere entre indivíduos.

Suplementar com o probiótico bem caracterizado Lactiplantibacillus pentosus apresenta uma forma viável de abordar a heterogeneidade no metabolismo dos polifenóis. Este probiótico pode ajudar a decompor químicos fenólicos complexos como GTs, melhorar a integridade da barreira intestinal e regular respostas imunológicas. L. pentosus pode trabalhar em conjunto com GTs para aumentar a biodisponibilidade de metabolitos vantajosos e ter um bom impacto na ecologia microbiana intestinal. Isto poderia então intensificar efeitos termogénicos e anti-inflamatórios, que poderiam aparecer como melhor saúde intestinal, níveis mais baixos de biomarcadores inflamatórios e perfis metabólicos melhorados, particularmente em pessoas obesas.

Esta descoberta tem ramificações importantes para vários campos. Ao avaliar uma abordagem combinada polifenol-probiótico projetada para alterar o metabolismo do hospedeiro através da microbiota intestinal, a ciência da nutrição avança o campo crescente de alimentos funcionais e nutracêuticos. Fornece informações para apoiar terapias dietéticas individualizadas para obesidade baseadas na composição microbiana e resposta metabólica individual, o que é consistente com os princípios da nutrição de precisão. Da perspetiva da saúde pública, os resultados podem ajudar a desenvolver métodos baseados em alimentos e escaláveis para reduzir o risco de doenças crónicas em grupos suscetíveis. A obesidade permanece um fator de risco significativo para doença cardiovascular, diabetes tipo 2 e alguns tipos de cancro. Portanto, encontrar intervenções dietéticas derivadas naturalmente, culturalmente aceites e facilmente acessíveis que melhorem resultados metabólicos e inflamatórios pode ser uma forma económica de prevenir e controlar doenças, particularmente em ambientes desfavorecidos.

Para investigação de doenças crónicas, o trabalho fornece insights mecanicistas sobre o papel dos polifenóis dietéticos e probióticos em influenciar a inflamação sistémica e disfunção metabólica. Pode ajudar a orientar futuros ensaios clínicos visando incorporar tratamentos direcionados ao microbioma em modelos de cuidados padrão para obesidade e outras doenças não transmissíveis. O estudo também tem implicações para as indústrias de frutas e agricultura, particularmente na promoção das propriedades funcionais das mangas e outras frutas ricas em polifenóis. Se bem-sucedido, este estudo aumentará a comercialização das mangas como um alimento promotor de saúde, impulsionará a procura e encorajará o desenvolvimento de produtos alimentares enriquecidos com polifenóis. Além disso, as descobertas podem informar práticas agrícolas visando aumentar o conteúdo de compostos bioativos em culturas de frutas.

Para além das mangas, este estudo estabelece as bases para investigar interações comparáveis em outras frutas ricas em polifenóis, como sumagre, alargando a relevância do estudo para diversas situações dietéticas culturais e geográficas. No campo da investigação do microbioma, este estudo avança a nossa compreensão de como compostos bioativos dietéticos interagem com taxa microbianos específicos para produzir metabolitos funcionais que afetam a saúde do hospedeiro. Avança a nossa compreensão da diversidade microbiana, bactérias produtoras de AGCC e vias microbianas relacionadas com inflamação em pessoas obesas. Finalmente, o estudo contribui para objetivos educacionais e de aprendizagem ao fornecer um exemplo prático de investigação nutricional translacional. Combina nutrição molecular, microbiologia e ciência comportamental, tornando-o um excelente estudo de caso para treinar estudantes e profissionais em ciências biomédicas e saúde pública interdisciplinares. Promove a abordagem de pensamento sistémico necessária para resolver problemas de saúde complexos usando soluções integrativas baseadas em alimentos.

Questões de Investigação

Para orientar esta investigação, o estudo foca-se em compreender como o extrato de GT de manga e a suplementação de Lactiplantibacillus pentosus afetam a microbiota intestinal e inflamação em indivíduos obesos através das seguintes questões:

• Como é que o tratamento com GTs, com ou sem L. pentosus, influencia a composição microbiana intestinal em adultos com obesidade?
• Qual é o impacto da suplementação com GT e L. pentosus em biomarcadores inflamatórios em indivíduos obesos?
• A variação genética entre indivíduos com obesidade explica o metabolismo dos galotaninos.
• A combinação de GTs e L. pentosus exibe efeitos sinérgicos na modulação de taxa microbianos específicos associados à obesidade e inflamação comparado com qualquer intervenção isoladamente?

Hipótese

1. Espera-se que haja uma correlação inversa entre o índice de massa corporal (IMC) e a concentração plasmática de GTs e metabolitos, bem como atividades termogénicas e anti-inflamatórias.
2. Espera-se que L. pentosus aumente os efeitos benéficos dos galotaninos

Objetivo e Objetivos Principal Objetivo O objetivo principal deste estudo piloto é investigar os efeitos dos galotaninos (GTs) da manga, com ou sem suplementação do probiótico L. pentosus, na composição da microbiota intestinal e marcadores inflamatórios em indivíduos obesos in vitro.

Objetivos Específicos

1. Avaliar as alterações na composição da microbiota intestinal em participantes obesos após tratamento com extrato de GT, com ou sem suplementação de L. pentosus.
2. Avaliar o potencial anti-inflamatório de GTs e L. pentosus individualmente e em combinação.
3. Identificar potenciais efeitos sinérgicos entre GTs e L. pentosus comparando diversidade microbiana, abundância de bactérias produtoras de AGCC e alterações de marcadores inflamatórios entre grupos de intervenção.

Justificação A ecologia microbiana intestinal perturbada e a inflamação crónica de baixo grau estão intimamente associadas à obesidade, e ambas têm um papel no desenvolvimento e progressão de distúrbios metabólicos. Para gerir eficazmente a obesidade, é imperativo abordar estas anormalidades metabólicas interligadas. As mangas são uma fonte rica de galotaninos (GTs), que demonstraram ter qualidades anti-inflamatórias, reguladoras metabólicas e pré-bióticas. No entanto, a capacidade do hospedeiro de os converter em derivados bioativos - uma capacidade que varia de acordo com a composição da microbiota intestinal - é crucial para as suas vantagens de saúde.

A suplementação probiótica com Lactiplantibacillus pentosus apresenta uma abordagem forte para superar esta limitação metabólica. Ao melhorar a função da barreira mucosa, regular respostas imunológicas e possivelmente auxiliar no metabolismo dos polifenóis, L. pentosus mostrou promessa em promover a saúde intestinal. Portanto, combinar este probiótico com manga rica em GT pode aumentar a exposição sistémica a metabolitos vantajosos de GT. Como observado em amostras de plasma e tecido adiposo, a ação combinada de regulação microbiana e biodisponibilidade melhorada de metabolitos pode produzir efeitos termogénicos e anti-inflamatórios mais notáveis, particularmente em pessoas obesas.

Apesar das vantagens esperadas, é importante reconhecer que quaisquer alterações na inflamação ou metabolismo observadas após tomar suplementos de L. pentosus podem não ser devidas exclusivamente a níveis elevados de metabolitos de GT. O probiótico em si pode ter efeitos biológicos por si só, como modificar o sistema imunitário do hospedeiro ou competir diretamente com bactérias que causam inflamação. Portanto, o propósito deste estudo é investigar as interações funcionais entre suplementação probiótica e refeições ricas em GT num ambiente prático e integrativo, em vez de identificar vias específicas de GT.

Considerando o interesse crescente em terapias direcionadas ao microbioma intestinal e nutrição personalizada, este estudo é necessário e oportuno. Oferecerá informações fundamentais sobre as formas em que interações entre polifenóis e probióticos afetam marcadores metabólicos e inflamatórios importantes nos grupos mais em risco de doença crónica. No final, os resultados podem influenciar recomendações dietéticas e planos de suplementação projetados para melhorar resultados de saúde em pessoas obesas usando técnicas conscientes do microbioma.

Metodologia Desenho do Estudo Este estudo é um ensaio clínico humano. O desenho do estudo é randomizado, duplamente cego, controlado por placebo. Aos participantes será pedido que forneçam amostras humanas como saliva, sangue e fezes. O estudo foi aprovado pelas Comissões de Revisão Institucional (IRB) da Prairie View A&M University (PVAMU) e da Texas A&M University e será registado em www.Clinicaltrials.gov.

População do Estudo Um total de 20 voluntários será recrutado para este estudo, com 15 pessoas que vivem com obesidade como parte do grupo de intervenção, enquanto 5 indivíduos magros e saudáveis formarão parte do grupo de controlo. Para o grupo de intervenção, os 15 voluntários serão randomizados em 3 grupos, com n=5 participantes por grupo. O recrutamento será feito partilhando panfletos de recrutamento em áreas-chave como mercearias, supermercados, igrejas, centros comunitários e outros centros de eventos no Condado de Waller e outros condados circundantes. Aos participantes serão feitas perguntas de triagem antes de os recrutar para o estudo.

Instrumentos Uma gama de instrumentos será usada para garantir recolha e análise de dados precisas. Células bucais serão recolhidas com zaragatoas bucais de ADN Isohelix SK-1, e amostras biológicas (plasma, urina e fezes) serão armazenadas a -80ºC em condições apropriadas. Biomarcadores inflamatórios e metabólicos serão medidos usando um ensaio multiplex baseado em esferas com análise no sistema Luminex L200 e software xPONENT. A genotipagem será conduzida com ensaios TaqMan para detetar variantes SNP selecionadas. O perfil do microbioma será realizado por extração de ADN com o Qiagen QIAamp DNA Stool Mini Kit, sequenciação em plataformas Illumina (MiSeq ou NovaSeq) e análise com QIIME2, bases de dados SILVA/Greengenes, LEfSe e PICRUSt2. A análise química de metabolitos de galotanino será realizada usando HPLC-ESI-MSn num triple quadrupolo Thermo Finnigan Altis e armadilha de iões de alta resolução HPLC-MS. Finalmente, ensaios imunes ex vivo envolverão estimulação de células mononucleares do sangue periférico com LPS, e os níveis de citocinas serão quantificados com o ensaio multiplex xMAP.

Recolha de Amostras Amostras de plasma serão recolhidas na linha de base, semana 1 após um jejum noturno. Alíquotas de plasma serão preparadas imediatamente após serem obtidas e armazenadas a -80ºC até análise. As fezes serão recolhidas conforme disponíveis e imediatamente tratadas anaerobicamente. Os participantes recolherão amostras de células bucais na linha de base usando zaragatoas bucais de ADN Isohelix SK-1 e cápsulas secas Isohelix.

Análise de Amostras Marcadores inflamatórios e metabólicos Amostras de plasma sanguíneo serão analisadas para avaliar níveis de vários biomarcadores inflamatórios. Estes incluirão citocinas inflamatórias como interleucina-10 (IL-10), proteína quimiotática de monócitos-1 (MCP-1); e o marcador cardiovascular proteína C-reativa (PCR). Todas as medições serão realizadas usando um ensaio multiplex baseado em esferas (Millipore, Billerica, MA).

Genotipagem ADN e loci genotipados específicos serão extraídos usando ensaios de genotipagem TaqMan para fornecer pontuação bi-alélica de polimorfismos de nucleótido único para os seguintes genes: associado à massa gorda e obesidade [FTO (rs9939609)] e desaturase de ácido gordo 1 [FADS1 (rs174546)].

Ensaio do Microbioma ADN microbiano será extraído de amostras de fezes usando o Qiagen QIAamp DNA Stool Mini Kit. Sequenciação do gene 16S rRNA (região V3-V4) será conduzida usando a plataforma Illumina MiSeq. Para análise mais profunda, sequenciação metagenómica shotgun será considerada usando a plataforma Illumina NovaSeq. Dados de sequência serão processados usando Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME)2. A classificação taxonómica utilizará as bases de dados SILVA ou Greengenes.

Índices de Diversidade:

• A diversidade alfa será calculada usando índices de Shannon e Chao1.
• A diversidade beta será avaliada usando distâncias de Bray-Curtis e UniFrac.

A análise de abundância diferencial será realizada usando LEfSe, e funções microbianas previstas serão inferidas via Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt2) usando R studio.

Análise Química Metabolitos de GT serão isolados primeiro centrifugando para remover biomassa e depois extraídos com acetato de etilo usando galato de etilo como padrão interno. Parâmetros de MS serão otimizados usando padrões dos metabolitos previstos quando disponíveis para a identificação de fragmentos pai/filha com a maior intensidade. Metabolitos alvo serão quantificados usando varredura completa, SRM (ião único) e MRM (monitorização de reação múltipla) num HPLC-ESI-MSn usando um triple quadrupolo Thermo Finnigan Altis usando padrões internos. Metabolitos não direcionados ou de baixa concentração serão identificados/quantificados no laboratório central de metabolómica da Texas A&M usando armadilha de iões de alta resolução HPLC-MS

Análise Estatística Todos os testes estatísticos serão realizados ao nível de 0,05 e serão bicaudais. Os dados serão examinados para normalidade, e todas as variáveis não normais serão transformadas log10. A análise será feita com base na intenção de tratar (ITT). Técnica ANOVA para desenhos crossover e, conforme necessário, suplementada por teste de postos de Wilcoxon equivalente. A mudança absoluta da linha de base será testada, e análises secundárias serão realizadas com base na mudança percentual da linha de base. O resultado primário é a mudança em biomarcadores de inflamação no plasma, uma vez que este resultado se aplica a indivíduos magros e obesos. Todos os outros resultados investigados serão tratados como resultados secundários. Análise secundária adicional dos efeitos do tratamento usará a Análise de Covariância baseada nas características basais do paciente. Atribuiremos metade dos pacientes aleatoriamente a cada uma das duas sequências de tratamento para manter um desenho experimental equilibrado. A randomização por blocos será como números de blocos mistos para proteger randomização e equilíbrio na atribuição de tratamento, eliminar possíveis enviesamentos e preservar cegamento. Cada bloco consistirá num indivíduo.

Considerações Éticas Aprovação ética foi solicitada e aprovada pela comissão de revisão institucional (IRB) da Texas A&M University e Prairie A&M University antes de proceder com recrutamento e recolha de dados. Isto é importante uma vez que este estudo envolve sujeitos humanos e é importante proteger os seus direitos e também manter total confidencialidade. Para manter confidencialidade, um formulário de consentimento será assinado por participantes que se qualifiquem para participar no estudo. O formulário de consentimento conterá a visão geral do estudo, informação do participante que será recolhida e amostras biológicas a recolher.