Effekter af gallotanniner på tarmsystemets mikrobiota og hvordan det påvirker inflammatoriske markører blandt overvægtige individer.

Introduktion Baggrund Fedme er en alvorlig, almindelig og dyr kronisk sygdom, og ifølge en rapport fra Center for Disease Control and Prevention lever mere end 2 ud af 5 voksne i USA med fedme. Problemet med fedme i USA er en stigende tendens, da rapporter har vist, at forekomsten af fedme blandt amerikanske voksne på 20 år og derover fra 2017 til 2020 var 41,9%, hvilket steg fra 30,5% i 2000. Samtidig steg forekomsten af svær fedme også fra 4,7% til 9,2%. Dette betyder, at over 100 millioner voksne i USA lever med fedme, mens mere end 22 millioner mennesker lever med svær fedme.

Den vigtigste årsag til fedme er unormal og overdreven lipidophobning i mange organer og væv, især i det viscerale eller abdominale område, herunder hvidt fedtvæv (WAT), som omtales som abdominal fedme. Denne type fedme påvirker betydeligt mange vigtige ikke-smittende sygdomme, såsom diabetes mellitus, metabolisk dysfunktions-associeret fedtleversygdom (MAFLD), kardiovaskulære sygdomme, hypertension og nyrelidelser. En af de vigtigste patogenetiske mekanismer ved fedme er foreslået at være nedsat adipogenese, eller processen med fedtcelledifferentiering.

Forøget oxidativ stress og inflammation er yderligere karakteristika ved usund WAT-omdannelse. Histologiske kronelignende strukturer (CLS'er) dannes, når forstørrede fedtceller frigiver kemokiner, der tiltrækker immunceller, primært makrofager, til at omringe fedtcellen. Ved at udløse proinflammatoriske regulatorer som nukleær faktor-kappa B (NF-κB), som igen øger produktionen af inflammatoriske gener og overvælder antiinflammatoriske regulatorer som interleukin 10 (IL10), intensiverer denne mekanisme den hyperinflammatoriske tilstand. Desuden kan reaktive oxygenarter (ROS)-induceret oxidativ stress overvælde antioxidantregulering, især den nukleære faktor erythroid 2-relaterede faktor 2 (NFE2L2/NRF2)-medierede udtryk af antioxidantgener.

Metaboliske problemer, såsom insulinresistens, dyslipidæmi og forstyrret adipogenese, forårsages af både oxidativ stress og inflammation. Derfor kan metoder til at undgå fedtcellehypertrofi, forbedre adipogenese for at skabe normale fedtceller, vende skadelig WAT-omdannelse og begrænse oxidativ stress og inflammation være effektive måder at bekæmpe fedme og metabolisk syndrom på.

Anvendelsen af kostintervention til forebyggelse og håndtering af fedme har været brugt i mange år og er beskrevet af forskere som grundlæggende. Indtagelse af måltider eller naturlige produkter, herunder frugter og grøntsager, der har lav energitæthed og er rige på bioaktive kemikalier, er blevet foreslået som en måde at håndtere fedme og tilknyttede problemer på. Spiselige vilde frugter og grøntsager fra forskellige områder er kendt for at indeholde en række bioaktive stoffer, herunder fenoliske stoffer, som kan have antiinflammatoriske, antioxidative og metabolisk-regulerende effekter. Frugtekstrakter, der indeholder flavonoider og polyfenoler, såsom quercetin, catechin og rutin, har vist positive effekter på markører for metabolisk dysfunktion. I dyremodeller af fedme inkluderer de reduktioner i fedtceller og makrofager, lipidophobning, visceralt fedtvæv og markører for inflammation og oxidativ stress.

Den høje koncentration af fenoliske stoffer (såsom gallussyre, gallotannin, galloyl-glycosider og flavonoider) i mangoer (Mangifera indica L.) tyder på, at de har stort antioxidativt og antiinflammatorisk potentiale, hvilket indikerer, at polyfenoler fra mangoer kan hjælpe med forebyggelse af kroniske sygdomme forbundet med fedme. Mangoforbrug reducerede fedme og forbedrede lipidprofil, glukosetolerance og inflammatorisk cytokinudtryk hos rotter fodret med en fedtrig kost i præklinisk forskning. Reduktionen af mitotisk klonal vækst, et afgørende trin i starten af fedtcelledifferentiering, er højst sandsynligt forbundet med hæmningen af adipogenese ved mangoekstrakter, ifølge en in vitro-model, der anvender 3T3-L1 preadipocytceller.

Humane kliniske undersøgelser har også vist, at mangotilskud sænker blodglukose hos overvægtige personer, personer med type 2-diabetes, og forbedrer raske voksnes lipidprofiler og antioxidative kapacitet. Hos overvægtige personer med hyperglykæmi er det blevet påvist, at naturlige fytokemikalier fra mangofrugter og deres metabolitter, såsom mangiferin, øger HDL-niveauer og sænker triglycerid- og frie fedtsyreniveauer. Ifølge disse resultater har polyfenoler ekstraheret fra mangoer stærke antiinflammatoriske og anti-lipogene egenskaber, der kan hjælpe med at forebygge kroniske lidelser forbundet med fedme.

Problemformulering Globalt er fedme blevet en epidemi af komplicerede, multivariate metaboliske problemer, der forårsager en stigning i forekomsten af kroniske tilstande som type 2-diabetes, hjertesygdom og flere typer kræft. En ændret tarmmikrobiel økologi, eller dysbiose, og en vedvarende lavgrads inflammatorisk tilstand er nøglekomponenter i patofysiologien af fedme. Reduceret population af gode bakterier, der producerer kortkædede fedtsyrer (SCFA'er), en stigning i proinflammatoriske taxa og et fald i mikrobiologisk diversitet er almindelige karakteristika ved denne dysbiotiske tilstand, som alle kan bidrage til opretholdelsen af metabolisk dysfunktion og systemisk inflammation. For at reducere inflammation og genoprette mikrobiologisk balance hos overvægtige personer er der stigende interesse for at skabe kostinterventioner.

Polyfenoler er velkendte for deres antiinflammatoriske, antioxidative og prebiotisk-lignende egenskaber, især gallotanniner (GT'er), som findes i mangoer. Efter at være nedbrudt af tarmmikroorganismer kan GT'er fremme væksten af gode bakterier og hæmme væksten af dårlige, men de nøjagtige effekter kan afhænge af sammensætningen af hver persons mikrobiota. Ligeledes forbedrer Lactiplantibacillus pentosus tarmslimhindens integritet og modulerer immunfunktionen, selvom dens effekter i isolering ofte er inkonsistente.

Lactiplantibacillus pentosus LPG1 (herefter omtalt som LPG1) er en fermentering afledt af bordoliven-biofilm, der har demonstreret probiotiske egenskaber i in vitro- og in vivo (murinmodel) undersøgelser. Denne stamme besidder antiinflammatoriske og fytaseegenskaber, kan sænke kolesterolniveauer, hæmmer fødevarebårne infektioner, fæster til Caco-2-celler og har ingen hæmolytisk aktivitet, blandt andre karakteristika. Desuden har kliniske undersøgelser demonstreret dens sikkerhed hos mennesker. I denne henseende opdagede en nylig undersøgelse, at L. pentosus LPG1-genomet mangler antibiotikaresistens- og virulensgener, mens det indeholder adskillige mulige gode bakterier, bacteriocin, exopolysaccharider, folatproduktionsklyngegener og fordøjelsesenzymer, der er i stand til at nedbryde komplekse kulhydrater som galactose, glykogen, stivelse, cellulose eller xylan.

Lactiplantibacillus-stammers probiotiske kapacitet er allerede blevet undersøgt i humane kliniske forsøg. Kotani undersøgte, hvorvidt L. pentosus b240, oprindeligt isoleret fra fermenterede teblade, kunne stimulere sekretion af salivært immunoglobulin A hos ældre. Wang undersøgte indvirkningen af oral indtagelse af Lactiplantibacillus pentosus Lp-8 på sammensætningen af fekalmikrobiotaen. de Vos studerede effekterne af oral indtagelse af flere L. pentosus-stammer på immunrespons, mens Rudzki undersøgte effekten af oral L. pentosus 299 på kognitive evner hos deprimerede patienter. For nylig undersøgte Ahn effekterne af en L. pentosus-stamme isoleret fra kimchi på børn med allergenfølsom atopisk dermatitis og viste forbedrede symptomer hos deltagerne.

Selvom det ikke er blevet undersøgt empirisk hos overvægtige personer, er muligheden for synergistisk regulering af metabolitter opnået fra mikroorganismer eller dæmpning af inflammatoriske indikatorer særlig interessant. Ved at vurdere effekterne af GT-ekstrakt, med eller uden L. pentosus-tilskud, på tarmmikrobiotaen og inflammation hos overvægtige voksne in vitro, sigter dette pilotstudie mod at lukke dette hul. Resultaterne vil guide fremtidige tilgange i personlig ernæring og fedmehåndtering ved at kaste lys over, hvorvidt polyfenol-probiotika kombinationer kan give flere sundhedsfordele end enkeltagentterapi.

Studiets betydning Kronisk lavgrads inflammation og forstyrret tarmmikrobiel økologi forstås nu som nøglefaktorer i udviklingen og progressionen af fedme og relaterede metaboliske sygdomme. Fremgangen i fedmeforebyggelses- og behandlingsindsatser afhænger af den effektive håndtering af disse sammenkædede dysfunktioner. En populær tropisk frugt, mangoer (Mangifera indica L.) er særligt rige på gallotanniner (GT'er), en underklasse af hydrolyserbare polyfenoler, der har vist sig at have antiinflammatoriske, antioxidative, metabolisk-regulerende og prebiotisk-lignende egenskaber. Dog er biotransformationen af GT'er til absorberbare, sundhedsfremmende metabolitter af tarmmikrober en vigtig faktor i deres bioaktivitet. De potentielle fordele ved polyfenoler genereret fra mangoer opnås ikke konsekvent på tværs af populationer, fordi mikrobiel sammensætning varierer mellem individer.

Tilskud med den velkarakteriserede probiotikum Lactiplantibacillus pentosus præsenterer en levedygtig måde at adressere heterogeniteten i polyfenolmetabolisme. Denne probiotikum kan hjælpe med at nedbryde komplekse fenoliske kemikalier som GT'er, forbedre tarmbarriereintegritet og regulere immunologiske responser. L. pentosus kan arbejde i tandem med GT'er for at øge bioaktiviteten af fordelagtige metabolitter og have en positiv indvirkning på tarmmikrobiel økologi. Dette kunne derefter intensivere termogene og antiinflammatoriske effekter, som kunne vise sig som bedre tarmhelbred, lavere niveauer af inflammatoriske biomarkører og forbedrede metaboliske profiler, især hos overvægtige personer.

Denne opdagelse har vigtige konsekvenser for en række områder. Ved at vurdere en kombineret polyfenol-probiotika-tilgang designet til at ændre værtens metabolisme gennem tarmmikrobiotaen, fremmer ernæringsvidenskaben det voksende felt af funktionelle fødevarer og nutraceuticals. Det giver information til at understøtte individualiserede kostinterventioner for fedme baseret på mikrobiel sammensætning og individuel metabolisk respons, hvilket er i overensstemmelse med principperne for præcisionsernæring. Fra et folkesundhedsperspektiv kan resultaterne hjælpe med at udvikle fødevarebaserede, skalerbare metoder til at reducere risikoen for kroniske sygdomme i sårbare grupper. Fedme forbliver en betydelig risikofaktor for kardiovaskulær sygdom, type 2-diabetes og visse typer kræft. Derfor kan det at finde naturligt afledte, kulturelt accepterede og let tilgængelige kostinterventioner, der forbedrer metaboliske og inflammatoriske resultater, være en økonomisk måde at forebygge og kontrollere sygdom på, især i underprivilegerede miljøer.

For kronisk sygdomsforskning giver arbejdet mekanistiske indsigter i rollen af kostpolyfenoler og probiotika i at påvirke systemisk inflammation og metabolisk dysfunktion. Det kunne hjælpe med at guide fremtidige kliniske forsøg, der sigter mod at inkorporere mikrobiom-målrettede behandlinger i standardplejemodeller for fedme og andre ikke-smittende sygdomme. Studiet har også implikationer for frugt- og landbrugsindustrien, især i at fremme de funktionelle egenskaber af mangoer og andre polyfenolrige frugter. Hvis succesfuldt vil dette studie øge mangoers markedsføringsevne som en sundhedsfremmende fødevare, drive efterspørgslen og tilskynde udviklingen af polyfenolforbedrede fødevareprodukter. Desuden kan resultaterne informere landbrugspraksis rettet mod at øge indholdet af bioaktive forbindelser i frugtafgrøder.

Ud over mangoer lægger dette studie grundlaget for at undersøge sammenlignelige interaktioner i andre polyfenolrige frugter, såsom sumak, hvilket udvider studiet relevans til forskellige kulturelle og geografiske kostforhold. Inden for mikrobiomforskning fremskynder dette studie vores forståelse af, hvordan kostbioaktive forbindelser interagerer med specifikke mikrobielle taxa for at producere funktionelle metabolitter, der påvirker værtens sundhed. Det fremmer vores forståelse af mikrobiel diversitet, SCFA-producerende bakterier og inflammation-relaterede mikrobielle veje hos overvægtige personer. Endelig bidrager studiet til uddannelses- og læringsmål ved at give et praktisk eksempel på translationel ernæringsforskning. Det kombinerer molekylær ernæring, mikrobiologi og adfærdsvidenskab, hvilket gør det til et fremragende casestudie for at træne studerende og praktikere i tværfaglig folkesundhed og biomedicinske videnskaber. Det fremmer den systemtænkende tilgang, der kræves for at løse komplekse sundhedsproblemer ved hjælp af integrative, fødevarebaserede løsninger.

Forskningsspørgsmål

For at guide denne undersøgelse fokuserer studiet på at forstå, hvordan GT-ekstrakt fra mango og Lactiplantibacillus pentosus-tilskud påvirker tarmmikrobiota og inflammation hos overvægtige individer gennem følgende spørgsmål:

• Hvordan påvirker behandling med GT'er, med eller uden L. pentosus, den tarmmikrobielle sammensætning hos voksne med fedme?
• Hvad er indvirkningen af GT- og L. pentosus-tilskud på inflammatoriske biomarkører hos overvægtige individer?
• Betyder genetisk variation blandt individer med fedme noget for metaboliseringen af gallotanniner.
• Viser kombinationen af GT'er og L. pentosus synergistiske effekter i moduleringen af specifikke mikrobielle taxa forbundet med fedme og inflammation sammenlignet med hver intervention alene?

Hypotese

1. Det forventes, at der er en omvendt korrelation mellem body mass index (BMI) og plasmakoncentrationen af GT'er og metabolitter, samt termogene og antiinflammatoriske aktiviteter.
2. L. pentosus forventes at øge de gavnlige effekter af gallotanniner

Formål og Mål Hovedformål Det primære mål med dette pilotstudie er at undersøge effekterne af gallotanniner (GT'er) fra mango, med eller uden tilskud af probiotikum L. pentosus, på tarmmikrobiotasammensætning og inflammatoriske markører hos overvægtige individer in vitro.

Specifikke Mål

1. At evaluere ændringerne i tarmmikrobiotasammensætning hos overvægtige deltagere efter behandling med GT-ekstrakt, med eller uden L. pentosus-tilskud.
2. At vurdere det antiinflammatoriske potentiale af GT'er og L. pentosus individuelt og i kombination.
3. At identificere potentielle synergistiske effekter mellem GT'er og L. pentosus ved at sammenligne mikrobiel diversitet, forekomst af SCFA-producerende bakterier og ændringer i inflammatoriske markører på tværs af interventionsgrupper.

Begrundelse Forstyrret tarmmikrobiel økologi og kronisk lavgrads inflammation er tæt forbundet med fedme, og begge har en rolle i udviklingen og progressionen af metaboliske lidelser. For effektivt at håndtere fedme er det afgørende at adressere disse sammenkædede metaboliske abnormiteter. Mangoer er en rig kilde til gallotanniner (GT'er), som har vist sig at have antiinflammatoriske, metabolisk-regulerende og prebiotisk-lignende egenskaber. Dog er værtens kapacitet til at konvertere dem til bioaktive derivater - en evne, der varierer i henhold til sammensætningen af tarmmikrobiotaen - afgørende for deres sundhedsfordele.

Lactiplantibacillus pentosus probiotisk tilskud præsenterer en stærk tilgang til at overvinde denne metaboliske begrænsning. Ved at forbedre slimhindebarrierefunktion, regulere immunologiske responser og muligvis hjælpe med polyfenolmetabolisme har L. pentosus vist potentiale til at fremme tarmhelbred. Derfor kan kombinationen af denne probiotikum med mango, der er rig på GT, øge systemisk eksponering for fordelagtige GT-metabolitter. Som set i plasma- og fedtvævsprøver kan kombinationshandlingen af mikrobiel regulering og forbedret metabolitbioaktibilitet producere mere mærkbare termogene og antiinflammatoriske effekter, især hos overvægtige personer.

På trods af de forventede fordele er det vigtigt at erkende, at eventuelle ændringer i inflammation eller metabolisme, der observeres efter indtagelse af L. pentosus-tilskud, muligvis ikke udelukkende skyldes forhøjede GT-metabolittniveauer. Probiotikummet i sig selv kan have biologiske effekter på egen hånd, såsom at modificere værtens immunsystem eller direkte konkurrere med bakterier, der forårsager inflammation. Derfor er formålet med dette studie at undersøge de funktionelle interaktioner mellem probiotisk tilskud og GT-rige fødevarer i en praktisk, integreret sammenhæng snarere end at identificere GT-specifikke veje.

I betragtning af den stigende interesse for tarmmikrobiom-målrettede terapier og personlig ernæring er dette studie både nødvendigt og rettidigt. Det vil give grundlæggende information om de måder, hvorpå interaktioner mellem polyfenoler og probiotika påvirker vigtige metaboliske og inflammatoriske markører i de grupper, der er mest i risiko for kronisk sygdom. I sidste ende kan resultaterne påvirke kostanbefalinger og tilskudplaner designet til at forbedre sundhedsresultater hos overvægtige personer ved hjælp af mikrobiombevidste teknikker.

Metodologi Studiedesign Dette studie er et humant klinisk forsøg. Studiedesignet er randomiseret, dobbeltblindet, placebokontrolleret. Deltagere vil blive bedt om at levere humane prøver som spyt, blod og afføring. Studiet er blevet godkendt af Institutional Review Boards (IRB) hos Prairie View A&M University (PVAMU) og Texas A&M University og vil blive registreret på www.Clinicaltrials.gov.

Studiepopulation I alt 20 frivillige vil blive rekrutteret til dette studie, med 15 personer, der lever med fedme som en del af interventionsgruppen, mens 5 slanke og raske individer vil udgøre en del af kontrolgruppen. For interventionsgruppen vil de 15 frivillige blive randomiseret i 3 grupper, med n=5 deltagere pr. gruppe. Rekruttering vil blive foretaget ved at dele rekrutteringsflyers på nøgleområder såsom dagligvarebutikker, supermarkeder, kirker, kommunecentre og andre begivenhedscentre i Waller County og andre omkringliggende counties. Deltagere vil blive stillet screeningsspørgsmål, før de rekrutteres til studiet.

Instrumenter En række instrumenter vil blive brugt til at sikre nøjagtig dataindsamling og analyse. Bukkale celler vil blive indsamlet med Isohelix SK-1 DNA buccalsvaber, og biologiske prøver (plasma, urin og afføring) vil blive opbevaret ved -80°C under passende forhold. Inflammatoriske og metaboliske biomarkører vil blive målt ved hjælp af en multiplex bead-baseret assay med analyse på Luminex L200-systemet og xPONENT-software. Genotypering vil blive udført med TaqMan-assays til at detektere udvalgte SNP-varianter. Mikrobiomprofilerings vil blive udført ved DNA-ekstraktion med Qiagen QIAamp DNA Stool Mini Kit, sekventering på Illumina-platforme (MiSeq eller NovaSeq) og analyse med QIIME2, SILVA/Greengenes-databaser, LEfSe og PICRUSt2. Kemisk analyse af gallotannin-metabolitter vil blive udført ved hjælp af HPLC-ESI-MSn på en Thermo Finnigan Altis triple quadrupole og HPLC-MS højopløsnings ionefælde. Endelig vil ex vivo immunassays involvere stimulering af perifere mononukleære blodceller med LPS, og cytokinniveauer vil blive kvantificeret med xMAP Multiplex Assay.

Prøveindsamling Plasmaprøver vil blive indsamlet ved baseline, uge 1 efter en natfasten. Alikvoter af plasma vil blive forberedt umiddelbart efter, at de er opnået, og opbevaret ved -80°C indtil analyse. Afføring vil blive indsamlet som tilgængelig og umiddelbart anaerobt behandlet. Deltagere vil indsamle bukkale celleprøver ved baseline ved hjælp af Isohelix SK-1 DNA buccalsvaber og Isohelix tørrede kapsler.

Prøveanalyse Inflammatoriske og metaboliske markører Blodplasmaprøver vil blive analyseret for at vurdere niveauer af forskellige inflammatoriske biomarkører. Disse vil inkludere inflammatoriske cytokiner såsom interleukin-10 (IL-10), monocyt kemotrahent protein-1 (MCP-1); og det kardiovaskulære markør C-reaktivt protein (CRP). Alle målinger vil blive udført ved hjælp af en multiplex bead-baseret assay (Millipore, Billerica, MA).

Genotypering DNA og genotyperede specifikke loci vil blive ekstraheret ved hjælp af TaqMan genotyperingsassays for at give bi-allelig scoring af enkeltnukleotidpolymorfier for følgende gener: fedtmasse og fedme-associeret [FTO (rs9939609)] og fedtsyre desaturase 1 [FADS1 (rs174546)].

Mikrobiomassay Mikrobielt DNA vil blive ekstraheret fra afføringsprøver ved hjælp af Qiagen QIAamp DNA Stool Mini Kit. 16S rRNA-gen sekventering (V3-V4-region) vil blive udført ved hjælp af Illumina MiSeq-platformen. Til dybere analyse vil shotgun metagenomisk sekventering blive overvejet ved hjælp af Illumina NovaSeq-platformen. Sekvensdata vil blive behandlet ved hjælp af Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME)2. Taxonomisk klassifikation vil anvende SILVA- eller Greengenes-databaser.

Diversitetsindekser:

• Alfa-diversitet vil blive beregnet ved hjælp af Shannon- og Chao1-indeks.
• Beta-diversitet vil blive vurderet ved hjælp af Bray-Curtis- og UniFrac-afstande.

Differential overflod analyse vil blive udført ved hjælp af LEfSe, og forudsagte mikrobielle funktioner vil blive afledt via Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt2) ved hjælp af R studio.

Kemisk analyse GT-metabolitter vil blive isoleret ved først at centrifugere for at fjerne biomasse og derefter ekstrahere med ethylacetat ved hjælp af ethylgallat som intern standard. MS-parametre vil blive optimeret ved hjælp af standarder af de forudsagte metabolitter, når tilgængelige, til identifikation af forælder/datter-fragmenter med højeste intensitet. Målmetabolitter vil blive kvantificeret ved hjælp af fuld scanning, SRM (enkelt ion) og MRM (multiple reaction monitoring) på en HPLC-ESI-MSn ved hjælp af en Thermo Finnigan Thermo Finnigan Altis triple quadrupole ved hjælp af interne standarder. Umlagte metabolitter eller lavkoncentrationsmetabolitter vil blive identificeret/kvantificeret i Texas A&M metabolomics kerne laboratorium ved hjælp af HPLC-MS højopløsnings ionefælde

Statistisk Analyse Al statistisk testning vil blive udført på 0,05-niveauet og vil være tosidet. Data vil blive undersøgt for normalitet, og alle ikke-normale variable vil blive log10 transformeret. Analyse vil blive udført på grundlag af intention to treat (ITT). ANOVA-teknik for crossover-designs og, efter behov, suppleret med tilsvarende Wilcoxon rank test. Absolut ændring fra baseline vil blive testet, og sekundære analyser vil blive udført baseret på procentændringen fra baseline. Det primære resultat er ændringen i inflammationsbiomarkører i plasma, da dette resultat gælder for slanke og overvægtige individer. Alle andre undersøgte resultater vil blive behandlet som sekundære resultater. Yderligere sekundær analyse af behandlingseffekter vil bruge Analysis of Covariance baseret på patienters baselinekarakteristika. Vi vil tildele halvdelen af patienterne tilfældigt til hver af de to behandlingssekvenser for at opretholde en afbalanceret eksperimentel design. Blokrandomisering vil være som blandede bloknumre for at beskytte randomisering og balance i behandlingstildeling, eliminere mulige bias og bevare blinding. Hver blok vil bestå af et individ.

Etiske Overvejelser Etisk godkendelse er blevet søgt og godkendt fra institutional review board (IRB) ved Texas A&M University og Prairie A&M University, før man fortsætter med rekruttering og dataindsamling. Dette er vigtigt, da dette studie involverer menneskelige forsøgspersoner, og det er vigtigt at beskytte deres rettigheder og også opretholde total fortrolighed. For at opretholde fortrolighed vil et samtykkeformular blive underskrevet af deltagere, der kvalificerer sig til at deltage i studiet. Samtykkeformularen vil indeholde oversigten over studiet, deltagerinformation, der vil blive indsamlet, og biologiske prøver, der skal indsamles.