Effektene av gallotanniner på tarmmikrobiota og hvordan det påvirker inflammatoriske markører hos overvektige individer.

Introduksjon Bakgrunn Fedme er en alvorlig, vanlig og kostbar kronisk sykdom, og ifølge en rapport fra Center for Disease Control and Prevention lever mer enn 2 av 5 voksne i USA med fedme. Problemstillingen med fedme i USA er en økende trend, da rapporter har vist at forekomsten av fedme blant amerikanske voksne i alderen 20 år og eldre fra 2017 til 2020 var 41,9 %, en økning fra 30,5 % i 2000. Samtidig økte forekomsten av alvorlig fedme også fra 4,7 % til 9,2 %. Dette betyr at over 100 millioner voksne i USA lever med fedme, mens mer enn 22 millioner mennesker lever med alvorlig fedme.

Hovedårsaken til fedme er unormal og overdreven fettansamling i mange organer og vev, spesielt i det viscerale eller abdominale området, inkludert hvitt fettvev (WAT), som omtales som abdominal fedme. Denne typen fedme påvirker betydelig mange viktige ikke-smittsomme sykdommer, som diabetes mellitus, metabolisk dysfunksjons-assosiert fettleversykdom (MAFLD), kardiovaskulære sykdommer, hypertensjon og nyrelidelser. En av de viktigste patogenetiske mekanismene i fedme er foreslått å være nedsatt adipogenese, eller prosessen med adipocytter-differensiering.

Økt oksidativt stress og betennelse er ytterligere kjennetegn ved usunn WAT-remodellering. Histologiske kronlignende strukturer (CLSs) dannes når forstørrede adipocytter frigjør kemokiner som tiltrekker seg immunceller, hovedsakelig makrofager, for å omringe adipocyttene. Ved å utløse pro-inflammatoriske regulatorer som nukleærfaktor-kappa B (NF-κB), som i sin tur øker produksjonen av inflammatoriske gener og overvinner anti-inflammatoriske regulatorer som interleukin 10 (IL10), intensiverer denne mekanismen den hyperinflammatoriske tilstanden. Videre kan reaktive oksygenarter (ROS)-indusert oksidativt stress overvinne antioksidantregulering, spesielt den nukleære faktor erythroid 2-relaterte faktor 2 (NFE2L2/NRF2)-medierte ekspresjonen av antioksidantgener.

Metaboliske problemer, som insulinresistens, dyslipidemi og forstyrret adipogenese, skyldes både oksidativt stress og betennelse. Derfor kan metoder for å unngå adipocytt-hypertrofi, forbedre adipogenese for å skape normale adipocytter, reversere skadelig WAT-remodellering og begrense oksidativt stress og betennelse være effektive måter å bekjempe fedme og metabolsk syndrom på.

Bruk av kostholdsintervensjon for fedmeforebygging og -behandling har blitt brukt i mange år og er beskrevet av forskere som grunnleggende. Å konsumere måltider eller naturprodukter, inkludert frukt og grønnsaker, som har lav energitetthet og høyt innhold av bioaktive kjemikalier, er foreslått som en måte å håndtere fedme og tilknyttede problemer på. Spiselige ville frukter og grønnsaker fra forskjellige områder er kjent for å inneholde en rekke bioaktive stoffer, inkludert fenoler, som kan ha anti-inflammatoriske, antioksidative og metabolsk-regulerende effekter. Fruktuttrekk som inneholder flavonoider og polyfenoler, som quercetin, katekin og rutin, har vist positive effekter på markører for metabolsk dysfunksjon. I dyremodeller for fedme inkluderer de reduksjoner i adipocytter og makrofager, fettansamling, visceralt fettvev og markører for betennelse og oksidativt stress.

Den høye konsentrasjonen av fenoliske stoffer (som gallussyre, gallotannin, galloyl-glykosider og flavonoider) i mango (Mangifera indica L.) tyder på at de har sterk antioksidativ og anti-inflammatorisk potensial, noe som indikerer at polyfenoler fra mango kan bidra til forebygging av kroniske sykdommer knyttet til fedme. Mangokonsum reduserte fedme og forbedret lipidprofil, glukosetoleranse og inflammatorisk cytokinuttrykk hos rotter gitt en høytfettdiett i preklinisk forskning. Reduksjonen av mitotisk klonal vekst, et avgjørende stadium i starten av adipocytter-differensiering, er mest sannsynlig knyttet til hemmingen av adipogenese av mangouttrekk, ifølge en in vitro-modell som bruker 3T3-L1 preadipocytteceller.

Humane kliniske undersøkelser har også vist at mangotilskudd senker blodglukose hos overvektige personer, personer med type 2-diabetes og friske voksnes lipidprofiler og antioksidantkapasitet. Hos overvektige personer med hyperglykemi har naturlige fytokjemikalier fra mangofrukt og deres metabolitter, som mangiferin, vist seg å øke HDL-nivåer og senke triglyserid- og frie fettsyrenivåer. I følge disse resultatene har polyfenoler ekstrahert fra mango sterke anti-inflammatoriske og anti-lipogene egenskaper som kan bidra til å forebygge kroniske lidelser knyttet til fedme.

Problemformulering Globalt har fedme blitt en epidemi av kompliserte, multivariate metabolske problemer som fører til en økning i forekomsten av kroniske tilstander som type 2-diabetes, hjertesykdom og flere typer kreft. En endret tarmmikrobiell økologi, eller dysbiose, og en vedvarende lavgradig inflammatorisk tilstand er nøkkelkomponenter i patofysiologien til fedme. Reduserte populasjoner av gunstige bakterier som produserer kortkjedede fettsyrer (SCFAs), en økning i pro-inflammatoriske taxa og en reduksjon i mikrobiell diversitet er vanlige kjennetegn ved denne dysbiotiske tilstanden, som alle kan bidra til opprettholdelse av metabolsk dysfunksjon og systemisk betennelse. For å redusere betennelse og gjenopprette mikrobiell balanse hos overvektige personer, er det økende interesse for å utvikle kostholdsintervensjoner.

Polyfenoler er velkjent for sine anti-inflammatoriske, antioksidative og prebiotisk-lignende egenskaper, spesielt gallotanniner (GTs), som finnes i mango. Etter å ha blitt brutt ned av tarmmikroorganismer, kan GTs fremme veksten av gode bakterier og hemme veksten av dårlige, men de nøyaktige effektene kan avhenge av sammensetningen av hvert individs mikrobiota. På samme måte forbedrer Lactiplantibacillus pentosus tarmslimhinnens integritet og modulerer immunfunksjon, selv om effektene i isolasjon ofte er inkonsistente.

Lactiplantibacillus pentosus LPG1 (heretter omtalt som LPG1) er et ferment utledet fra bordolivenbiofilmer som har vist probiotiske egenskaper i in vitro- og in vivo (musemodell) undersøkelser. Denne stammen har anti-inflammatoriske og fytaseegenskaper, kan senke kolesterolnivåer, hemmer matbårne infeksjoner, fester seg til Caco-2-celler og har ingen hemolytisk aktivitet, blant andre egenskaper. Videre har kliniske undersøkelser vist dens sikkerhet hos mennesker. I denne forbindelse oppdaget en nylig studie at L. pentosus LPG1-genomet mangler antibiotikaresistens- og virulensgener mens det inneholder mange mulige gunstige bakterier, bakteriosin, eksopolysakkarider, folatproduksjonsklyngegener og fordøyelsesenzymer som er i stand til å bryte ned komplekse karbohydrater som galaktose, glykogen, stivelse, cellulose eller xylan.

Lactiplantibacillus-stammers probiotiske kapasitet har allerede blitt studert i humane kliniske studier. Kotani undersøkte evnen til L. pentosus b240, opprinnelig isolert fra fermenterte teblader, til å stimulere sekresjon av salivært immunoglobulin A hos eldre. Wang undersøkte påvirkningen av oral inntak av Lactiplantibacillus pentosus Lp-8 på sammensetningen av fekalmikrobiotaen. de Vos studerte effektene av oral inntak av flere L. pentosus-stammer på immunrespons, mens Rudzki undersøkte effekten av oral L. pentosus 299 på kognitive ferdigheter hos deprimerte pasienter. Nylig undersøkte Ahn effektene av en L. pentosus-stamme isolert fra kimchi, på barn med allergenfølsom atopisk dermatitt og viste forbedrede symptomer hos deltakerne.

Selv om det ikke er utforsket empirisk hos overvektige personer, er muligheten for synergistisk regulering av metabolitter fra mikroorganismer eller dempning av inflammatoriske indikatorer spesielt interessant. Ved å vurdere effektene av GT-ekstrakt, med eller uten L. pentosus-tilskudd, på tarmmikrobiotaen og betennelse hos overvektige voksne in vitro, har denne pilotstudien som mål å fylle dette gapet. Resultatene vil veilede fremtidige tilnærminger i personalisert ernæring og fedmebehandling ved å kaste lys på om polyfenol-probiotika-kombinasjoner kan gi flere helsefordeler enn enkeltagentbehandling.

Studiens betydning Kronisk lavgradig betennelse og forstyrret tarmmikrobiell økologi forstås nå som nøkkelfaktorer i utviklingen og progresjonen av fedme og relaterte metabolske sykdommer. Fremgangen i fedmeforebygging og behandlingsinnsatser avhenger av effektiv håndtering av disse sammenkoblede dysfunksjonene. En populær tropisk frukt, mango (Mangifera indica L.) er spesielt rik på gallotanniner (GTs), en underklasse av hydrolysérbare polyfenoler som har vist seg å ha anti-inflammatoriske, antioksidative, metabolsk-regulerende og prebiotisk-lignende egenskaper. Imidlertid er biotransformasjonen av GTs til absorberbare, helsefremmende metabolitter av tarmmikrober en viktig faktor i deres bioaktivitet. De potensielle fordelene med polyfenoler fra mango oppnås ikke konsekvent på tvers av populasjoner fordi mikrobiell sammensetning varierer mellom individer.

Tilskudd med den velkarakteriserte probiotikaen Lactiplantibacillus pentosus presenterer en levedyktig måte å adressere heterogeniteten i polyfenolmetabolisme på. Denne probiotikaen kan bidra til å bryte ned komplekse fenoliske kjemikalier som GTs, forbedre tarmbarrierens integritet og regulere immunresponser. L. pentosus kan arbeide i tandem med GTs for å øke biodisponibiliteten av fordelaktige metabolitter og ha en positiv innvirkning på tarmmikrobiell økologi. Dette kan deretter intensivere termogene og anti-inflammatoriske effekter, som kan manifestere seg som bedre tarmhelse, lavere nivåer av inflammatoriske biomarkører og forbedrede metabolske profiler, spesielt hos overvektige personer.

Denne oppdagelsen har viktige implikasjoner for en rekke felt. Ved å vurdere en kombinert polyfenol-probiotika-tilnærming designet for å endre vertsmetabolisme gjennom tarmmikrobiotaen, fremmer ernæringsvitenskapen det voksende feltet av funksjonelle matvarer og næringsmidler. Den gir informasjon for å støtte individualiserte kostholdsterapier for fedme basert på mikrobiell sammensetning og individuell metabolsk respons, som er i tråd med prinsippene for presisjonsernæring. Fra et folkehelseperspektiv kan resultatene bidra til å utvikle matbaserte, skalerbare metoder for å redusere risikoen for kroniske sykdommer i sårbare grupper. Fedme forblir en betydelig risikofaktor for kardiovaskulær sykdom, type 2-diabetes og noen typer kreft. Derfor kan det å finne naturlig avledede, kulturelt aksepterte og lett tilgjengelige kostholdsintervensjoner som forbedrer metabolske og inflammatoriske utfall være en økonomisk måte å forebygge og kontrollere sykdom på, spesielt i underprivilegerte miljøer.

For kronisk sykdomsforskning gir arbeidet mekanistiske innsikter i rollen til kostholdspolyfenoler og probiotika i å påvirke systemisk betennelse og metabolsk dysfunksjon. Det kan bidra til å veilede fremtidige kliniske studier som tar sikte på å inkorporere mikrobiom-målrettede behandlinger i standard behandlingsmodeller for fedme og andre ikke-smittsomme sykdommer. Studien har også implikasjoner for frukt- og landbruksindustrien, spesielt i å fremme de funksjonelle egenskapene til mango og andre polyfenolrike frukter. Hvis vellykket, vil denne studien øke mangos markedsføringsevne som en helsefremmende matvare, øke etterspørselen og oppmuntre til utvikling av polyfenolforsterkede matprodukter. Videre kan funnene informere landbrukspraksiser rettet mot å øke innholdet av bioaktive forbindelser i fruktavlinger.

Bortenfor mango, legger denne studien grunnlaget for å undersøke sammenlignbare interaksjoner i andre polyfenolrike frukter, som sumak, og utvider studiens relevans til ulike kulturelle og geografiske kostholdssituasjoner. Innen mikrobiomforskning fremmer denne studien vår forståelse av hvordan kostholdets bioaktive forbindelser samhandler med spesifikke mikrobielle taxa for å produsere funksjonelle metabolitter som påvirker vertens helse. Den videreutvikler vår forståelse av mikrobiell diversitet, SCFA-produserende bakterier og inflammasjonsrelaterte mikrobielle baner hos overvektige personer. Til slutt bidrar studien til utdannings- og læringsmål ved å gi et praktisk eksempel på translasjonsernæringsforskning. Den kombinerer molekylær ernæring, mikrobiologi og atferdsvitenskap, noe som gjør den til et utmerket casestudie for å trene studenter og praktikere i tverrfaglig folkehelse og biomedisinske vitenskaper. Den fremmer systemtenkningen som kreves for å løse komplekse helseproblemer ved hjelp av integrerte, matbaserte løsninger.

Forskningsspørsmål

For å veilede denne undersøkelsen, fokuserer studien på å forstå hvordan GT-ekstrakt fra mango og Lactiplantibacillus pentosus-tilskudd påvirker tarmmikrobiotaen og betennelse hos overvektige individer gjennom følgende spørsmål:

• Hvordan påvirker behandling med GTs, med eller uten L. pentosus, den mikrobielle sammensetningen i tarmen hos voksne med fedme?
• Hva er effekten av GT- og L. pentosus-tilskudd på inflammatoriske biomarkører hos overvektige individer?
• Kan genetisk variasjon mellom individer med fedme forklare metabolisering av gallotanniner.
• Viser kombinasjonen av GTs og L. pentosus synergistiske effekter i modulering av spesifikke mikrobielle taxa assosiert med fedme og betennelse sammenlignet med hver intervensjon alene?

Hypotese

1. Det forventes en omvendt korrelasjon mellom kroppsmasseindeks (KMI) og plasmakonsentrasjon av GTs og metabolitter, samt termogene og anti-inflammatoriske aktiviteter.
2. L. pentosus forventes å øke de gunstige effektene av gallotanniner

Mål og målsettinger Hovedmål Det primære målet med denne pilotstudien er å undersøke effektene av gallotanniner (GTs) fra mango, med eller uten tilskudd av probiotikaen L. pentosus, på tarmmikrobiotasammensetning og inflammatoriske markører hos overvektige individer in vitro.

Spesifikke mål

1. Å evaluere endringer i tarmmikrobiotasammensetning hos overvektige deltakere etter behandling med GT-ekstrakt, med eller uten L. pentosus-tilskudd.
2. Å vurdere den anti-inflammatoriske potensialen til GTs og L. pentosus individuelt og i kombinasjon.
3. Å identifisere potensielle synergistiske effekter mellom GTs og L. pentosus ved å sammenligne mikrobiell diversitet, overflod av SCFA-produserende bakterier og endringer i inflammatoriske markører på tvers av intervensjonsgrupper.

Begrunnelse Forstyrret tarmmikrobiell økologi og kronisk lavgradig betennelse er nært assosiert med fedme, og begge spiller en rolle i utviklingen og progresjonen av metabolske lidelser. For å håndtere fedme effektivt, er det avgjørende å adressere disse sammenkoblede metabolske abnormitetene. Mango er en rik kilde til gallotanniner (GTs), som har vist seg å ha anti-inflammatoriske, metabolsk-regulerende og prebiotisk-lignende egenskaper. Imidlertid er vertens kapasitet til å konvertere dem til bioaktive derivater—en evne som varierer i henhold til sammensetningen av tarmmikrobiotaen—avgjørende for deres helsefordeler.

Lactiplantibacillus pentosus probiotisk tilskudd presenterer en sterk tilnærming for å overvinne denne metabolske begrensningen. Ved å forbedre slimhinnebarrierens funksjon, regulere immunresponser og kanskje bistå i polyfenolmetabolisme, har L. pentosus vist potensial i å fremme tarmhelse. Derfor kan kombinasjonen av denne probiotikaen med mango som er rik på GT øke systemisk eksponering for fordelaktige GT-metabolitter. Som observert i plasma- og fettvevsprøver, kan kombinasjonseffekten av mikrobiel regulering og forbedret metabolitbiodisponibilitet produsere mer merkbare termogene og anti-inflammatoriske effekter, spesielt hos overvektige personer.

Til tross for de forventede fordelene, er det viktig å erkjenne at eventuelle endringer i betennelse eller metabolisme som observeres etter å ha tatt L. pentosus-tilskudd kanskje ikke utelukkende skyldes økte GT-metabolittnivåer. Probiotikaen i seg selv kan ha biologiske effekter på egen hånd, som å modifisere vertens immunsystem eller direkte konkurrere med bakterier som forårsaker betennelse. Derfor er formålet med denne studien å undersøke de funksjonelle interaksjonene mellom probiotisk tilskudd og GT-rike måltider i en praktisk, integrert setting snarere enn å identifisere GT-spesifikke baner.

Med tanke på den økende interessen for tarmmikrobiom-målrettede terapier og personalisert ernæring, er denne studien både nødvendig og aktuell. Den vil gi grunnleggende informasjon om måtene interaksjoner mellom polyfenoler og probiotika påvirker viktige metabolske og inflammatoriske markører i gruppene med størst risiko for kronisk sykdom. Til slutt kan resultatene påvirke kostholdsråd og tilskuddsplaner designet for å forbedre helseutfall hos overvektige personer ved bruk av mikrobiombevisste teknikker.

Metodologi Studiedesign Denne studien er en human klinisk studie. Studiedesignet er randomisert, dobbeltblindet, placebokontrollert. Deltakere vil bli bedt om å gi humane prøver som spytt, blod og avføring. Studien har blitt godkjent av Institutional Review Boards (IRB) ved Prairie View A&M University (PVAMU) og Texas A&M University og vil bli registrert på www.Clinicaltrials.gov.

Studiepopulasjon Totalt 20 frivillige vil bli rekruttert for denne studien, med 15 personer som lever med fedme som en del av intervensjonsgruppen, mens 5 slanke og friske individer vil utgjøre kontrollgruppen. For intervensjonsgruppen vil de 15 frivillige bli randomisert i 3 grupper, med n=5 deltakere per gruppe. Rekruttering vil bli gjort ved å dele rekrutteringsflyers på viktige områder som dagligvarebutikker, supermarkeder, kirker, samfunnssentre og andre arrangementsentre i Waller County og andre omkringliggende fylker. Deltakere vil bli stilt screeningspørsmål før de rekrutteres til studien.

Instrumenter En rekke instrumenter vil bli brukt for å sikre nøyaktig datainnsamling og analyse. Buccalceller vil bli samlet med Isohelix SK-1 DNA buccal swabs, og biologiske prøver (plasma, urin og avføring) vil bli lagret ved -80°C under passende forhold. Inflammatoriske og metabolske biomarkører vil bli målt ved hjelp av en multiplex bead-basert assay med analyse på Luminex L200-systemet og xPONENT-programvare. Genotyping vil bli utført med TaqMan-assays for å detektere utvalgte SNP-varianter. Mikrobiomprofilering vil bli utført ved DNA-ekstraksjon med Qiagen QIAamp DNA Stool Mini Kit, sekvensering på Illumina-plattformer (MiSeq eller NovaSeq), og analyse med QIIME2, SILVA/Greengenes-databaser, LEfSe og PICRUSt2. Kjemisk analyse av gallotanninmetabolitter vil bli utført ved hjelp av HPLC-ESI-MSn på en Thermo Finnigan Altis triple quadrupole og HPLC-MS høyoppløselig ionefelle. Til slutt vil ex vivo immunassays involvere stimulering av perifere mononukleære blodceller med LPS, og cytokinnivåer vil bli kvantifisert med xMAP Multiplex Assay.

Prøveinnsamling Plasmaprøver vil bli samlet ved baseline, uke 1 etter en nattfasting. Alikvoter av plasma vil bli tilberedt umiddelbart etter at de er innhentet og lagret ved -80°C til analyse. Avføring vil bli samlet etter tilgjengelighet og umiddelbart anaerobt behandlet. Deltakere vil samle buccal cellprøver ved baseline ved bruk av Isohelix SK-1 DNA buccal swabs og Isohelix tørrkapsler.

Prøveanalyse Inflammatoriske og metabolske markører Blodplasmaprøver vil bli analysert for å vurdere nivåer av ulike inflammatoriske biomarkører. Disse vil inkludere inflammatoriske cytokiner som interleukin-10 (IL-10), monocyt kemotaktisk protein-1 (MCP-1); og den kardiovaskulære markøren C-reaktivt protein (CRP). Alle målinger vil bli utført ved hjelp av en multiplex bead-basert assay (Millipore, Billerica, MA).

Genotyping DNA og genotyperte spesifikke loci vil bli ekstrahert ved bruk av TaqMan genotyping assays for å gi bi-allell scoring av enkeltnukleotidpolymorfismer for følgende gener: fettmasse- og fedme-assosiert [FTO (rs9939609)] og fettsyrer desaturase 1 [FADS1 (rs174546)].

Mikrobiomassay Mikrobielt DNA vil bli ekstrahert fra avføringsprøver ved bruk av Qiagen QIAamp DNA Stool Mini Kit. 16S rRNA-gensekvensering (V3-V4-region) vil bli utført ved bruk av Illumina MiSeq-plattformen. For dypere analyse vil shotgun metagenomisk sekvensering bli vurdert ved bruk av Illumina NovaSeq-plattformen. Sekvensdata vil bli prosessert ved bruk av Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME)2. Taksonomisk klassifisering vil benytte SILVA- eller Greengenes-databaser.

Diversitetsindekser:

• Alfa-diversitet vil bli beregnet ved bruk av Shannon- og Chao1-indekser.
• Beta-diversitet vil bli vurdert ved bruk av Bray-Curtis- og UniFrac-avstander.

Differensiell overflodanalyse vil bli utført ved bruk av LEfSe, og predikerte mikrobielle funksjoner vil bli utledet via Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt2) ved bruk av R studio.

Kjemisk analyse GT-metabolitter vil bli isolert ved først å sentrifugere for å fjerne biomasse og deretter ekstrahere med etylacetat ved bruk av etylgallat som intern standard. MS-parametere vil bli optimalisert ved bruk av standarder av de predikerte metabolittene når tilgjengelige for identifikasjon av foreldre/datterfragmenter med høyest intensitet. Målmetabolitter vil bli kvantifisert ved bruk av full skanning, SRM (enkeltion) og MRM (multippel reaksjonsmonitorering) på en HPLC-ESI-MSn ved bruk av en Thermo Finnigan Thermo Finnigan Altis triple quadrupole ved bruk av interne standarder. Umålrettede metabolitter eller lavkonsentrasjonsmetabolitter vil bli identifisert/kvantifisert i Texas A&M metabolomics kjerne-laboratorium ved bruk av HPLC-MS høyoppløselig ionefelle

Statistisk analyse All statistisk testing vil bli utført på 0,05-nivå og vil være tosidig. Data vil bli undersøkt for normalitet, og alle ikke-normale variabler vil bli log10-transformert. Analyse vil bli gjort på grunnlag av intensjon til å behandle (ITT). ANOVA-teknikk for crossover-design og, etter behov, supplert med ekvivalent Wilcoxon rangtest. Absolutt endring fra baseline vil bli testet, og sekundære analyser vil bli utført basert på prosentvis endring fra baseline. Det primære utfallet er endringen i inflammasjonsbiomarkører i plasma, siden dette utfallet gjelder både slanke og overvektige individer. Alle andre utforskede utfall vil bli behandlet som sekundære utfall. Videre sekundær analyse av behandlingseffekter vil bruke analyse av kovarians basert på pasientens baselinekarakteristikker. Vi vil tildele halvparten av pasientene tilfeldig til hver av de to behandlingssekvensene for å opprettholde et balansert eksperimentelt design. Blokkrandomisering vil være som blandede blokknumre for å beskytte randomisering og balanse i behandlingstildeling, eliminere mulige bias og bevare blinding. Hver blokk vil bestå av en individ.

Etiske hensyn Etisk godkjenning er søkt og innhentet fra Institutional Review Board (IRB) ved Texas A&M University og Prairie A&M University før rekruttering og datainnsamling fortsetter. Dette er viktig siden denne studien involverer menneskelige forsøkspersoner, og det er viktig å beskytte deres rettigheter og også opprettholde total konfidensialitet. For å opprettholde konfidensialitet vil et samtykkeskjema bli signert av deltakere som kvalifiserer til å delta i studien. Samtykkeskjemaet vil inneholde oversikt over studien, deltakerinformasjon som vil bli samlet inn, og biologiske prøver som skal samles inn.