没食子单宁对肥胖人群肠道微生物群的影响及其如何影响炎症标志物。

引言背景 肥胖是一种严重、常见且昂贵的慢性疾病。根据美国疾病控制与预防中心的报告，超过五分之二的美国成年人患有肥胖症。 美国的肥胖问题呈上升趋势，报告显示2017年至2020年间美国20岁及以上成年人的肥胖患病率为41.9%，较2000年的30.5%有所上升。 与此同时，严重肥胖的患病率也从4.7%上升至9.2%。 这意味着美国有超过1亿成年人患有肥胖症，而超过2200万人患有严重肥胖症。

肥胖的主要原因是许多器官和组织中脂质异常和过度堆积，特别是在内脏或腹部区域，包括白色脂肪组织（WAT），这被称为腹部肥胖。 许多重要的非传染性疾病，如糖尿病、代谢功能障碍相关脂肪肝病（MAFLD）、心血管疾病、高血压和肾脏疾病，都受到这种肥胖类型的显著影响。 肥胖的主要致病机制之一被认为是脂肪生成受损，即脂肪细胞分化过程。

氧化应激增加和炎症是白色脂肪组织不健康重塑的进一步特征。 当增大的脂肪细胞释放趋化因子吸引免疫细胞（主要是巨噬细胞）包围脂肪细胞时，会形成组织学上的冠状样结构（CLSs）。 通过触发促炎调节因子如核因子-κB（NF-κB），进而促进炎症基因的产生并压倒抗炎调节因子如白细胞介素10（IL10），这种机制加剧了过度炎症状态。 此外，活性氧（ROS）诱导的氧化应激可能压倒抗氧化调节，特别是核因子红细胞2相关因子2（NFE2L2/NRF2）介导的抗氧化基因表达。

氧化应激和炎症共同导致代谢问题，如胰岛素抵抗、血脂异常和脂肪生成紊乱。 因此，避免脂肪细胞肥大、改善脂肪生成以形成正常脂肪细胞、逆转有害的白色脂肪组织重塑以及限制氧化应激和炎症的方法，可能是对抗肥胖和代谢综合征的有效途径。

饮食干预用于肥胖预防和管理已有多年历史，被研究人员描述为基础方法。 建议摄入低能量密度、高生物活性化学物质的膳食或天然产品（包括水果和蔬菜）作为管理肥胖及其相关问题的方法。 已知来自不同地区的可食用野生水果和蔬菜含有多种生物活性物质，包括酚类物质，可能具有抗炎、抗氧化和代谢调节作用。 含有类黄酮和多酚（如槲皮素、儿茶素和芦丁）的水果提取物已显示出对代谢功能障碍标志物的积极益处。 在肥胖动物模型中，这些益处包括减少脂肪细胞和巨噬细胞、脂质堆积、内脏脂肪组织以及炎症和氧化应激标志物。

芒果（Mangifera indica L.）中高浓度的酚类物质（如没食子酸、没食子单宁、没食子酰糖苷和类黄酮）表明其具有强大的抗氧化和抗炎潜力，表明从芒果中提取的多酚有助于预防与肥胖相关的慢性疾病。 在临床前研究中，摄入芒果减少了高脂饮食大鼠的肥胖，并改善了血脂谱、葡萄糖耐量和炎症细胞因子表达。 根据使用3T3-L1前脂肪细胞进行的体外模型，芒果提取物抑制脂肪生成很可能与减少有丝分裂克隆扩增（脂肪细胞分化起始的关键阶段）有关。

人体临床研究也表明，补充芒果可降低肥胖人群、2型糖尿病患者以及健康成年人的血糖、血脂谱和抗氧化能力。 在患有高血糖的超重人群中，芒果果实中的天然植物化学物质及其代谢物（如芒果苷）已被证明可以提高高密度脂蛋白水平，并降低甘油三酯和游离脂肪酸水平。 根据这些结果，从芒果中提取的多酚具有强大的抗炎和抗脂肪生成特性，可能有助于预防与肥胖相关的慢性疾病。

问题陈述 在全球范围内，肥胖已成为一种复杂的多变量代谢问题流行病，导致2型糖尿病、心脏病和多种癌症等慢性疾病的患病率增加。 改变的肠道微生物生态（即菌群失调）和持续的低度炎症状态是肥胖病理生理学的关键组成部分。 这种菌群失调状态的常见特征包括产生短链脂肪酸（SCFAs）的有益细菌数量减少、促炎类群增加以及微生物多样性降低，这些都可能有助于维持代谢功能障碍和全身炎症。 为了减少炎症并恢复肥胖人群的微生物平衡，人们对制定饮食干预措施越来越感兴趣。

多酚以其抗炎、抗氧化和益生元样特性而闻名，尤其是芒果中存在的没食子单宁（GTs）。 GTs被肠道微生物分解后，可能促进有益细菌的生长并抑制有害细菌的生长，但具体效果可能取决于每个个体微生物群的组成。 同样，戊糖乳杆菌（Lactiplantibacillus pentosus）可增强肠道黏膜完整性并调节免疫功能，尽管其单独作用往往不一致。

戊糖乳杆菌LPG1（以下简称LPG1）是一种从食用橄榄生物膜中提取的发酵产物，已在体外和体内（小鼠模型）研究中显示出益生菌特性。 该菌株具有抗炎和植酸酶特性，可以降低胆固醇水平，抑制食源性感染，附着于Caco-2细胞，且无溶血活性等特性。 此外，临床研究已证明其对人体安全。 在这方面，最近的一项研究发现，戊糖乳杆菌LPG1基因组缺乏抗生素抗性和毒力基因，同时含有多种潜在有益细菌、细菌素、胞外多糖、叶酸生产簇基因以及能够分解复杂碳水化合物（如半乳糖、糖原、淀粉、纤维素或木聚糖）的消化酶。

戊糖乳杆菌菌株的益生菌能力已在人体临床试验中得到研究。 Kotani研究了最初从发酵茶叶中分离的戊糖乳杆菌b240刺激老年人唾液免疫球蛋白A分泌的能力。 Wang研究了口服戊糖乳杆菌Lp-8对粪便微生物群组成的影响。 de Vos研究了几种戊糖乳杆菌菌株口服摄入对免疫反应的影响，而Rudzki研究了口服戊糖乳杆菌299对抑郁症患者认知能力的影响。 最近，Ahn研究了从泡菜中分离的戊糖乳杆菌菌株对过敏原敏感性特应性皮炎儿童的影响，并显示参与者的症状有所改善。

尽管尚未在肥胖人群中进行实证探索，但微生物来源的代谢物协同调节或炎症指标减弱的可能性尤其引人注目。 通过评估GT提取物（无论是否补充戊糖乳杆菌）对肥胖成年人肠道微生物群和炎症的体外影响，本试点研究旨在填补这一空白。 研究结果将阐明多酚-益生菌组合是否能比单一疗法提供更多健康益处，从而指导未来个性化营养和肥胖管理的策略。

研究意义 慢性低度炎症和肠道微生物生态紊乱现在被认为是肥胖及相关代谢疾病发生和发展的关键因素。 肥胖预防和治疗工作的进展取决于对这些相互关联的功能障碍的有效管理。 芒果（Mangifera indica L.）是一种受欢迎的热带水果，尤其富含没食子单宁（GTs），这是一种可水解多酚亚类，已被证明具有抗炎、抗氧化、代谢调节和益生元样特性。 然而，肠道微生物将GTs生物转化为可吸收、促进健康的代谢物是其生物活性的主要因素。 由于个体间微生物组成存在差异，芒果来源的多酚的潜在益处并非在所有人群中都能一致实现。

补充经过充分表征的益生菌戊糖乳杆菌为解决多酚代谢的异质性提供了一种可行的方法。 这种益生菌可能有助于分解复杂的酚类化学物质（如GTs），改善肠道屏障完整性，并调节免疫反应。 戊糖乳杆菌可能与GTs协同作用，增加有益代谢物的生物利用度，并对肠道微生物生态产生积极影响。 这可能进而增强产热和抗炎作用，表现为改善肠道健康、降低炎症生物标志物水平以及改善代谢谱，尤其是在肥胖人群中。

这一发现对多个领域具有重要意义。 通过评估旨在通过肠道微生物群改变宿主代谢的联合多酚-益生菌方法，营养科学推动了功能性食品和营养保健品这一不断发展的领域。 它提供了支持基于微生物组成和个体代谢反应的个性化肥胖饮食疗法的信息，这与精准营养的原则一致。 从公共卫生的角度来看，研究结果可以帮助制定基于食物的可扩展方法，以降低易感群体的慢性疾病风险。 肥胖仍然是心血管疾病、2型糖尿病和某些类型癌症的重要风险因素。 因此，寻找天然来源、文化接受度高且易于获取的饮食干预措施来改善代谢和炎症结果，可能是一种经济有效的疾病预防和控制方法，特别是在资源匮乏的环境中。

对于慢性疾病研究，这项工作提供了关于膳食多酚和益生菌在影响全身炎症和代谢功能障碍中的作用的机制见解。 它可能有助于指导未来的临床试验，旨在将微生物群靶向治疗纳入肥胖和其他非传染性疾病的标准护理模式。 该研究还对水果和农业产业具有影响，特别是在推广芒果和其他富含多酚的水果的功能特性方面。 如果成功，这项研究将提高芒果作为健康促进食品的市场性，推动需求，并鼓励开发多酚强化食品。 此外，研究结果可以为旨在提高水果作物中生物活性化合物含量的农业实践提供信息。

除了芒果，这项研究为探索其他富含多酚的水果（如漆树）中类似的相互作用奠定了基础，扩大了研究对不同文化和地理饮食情况的适用性。 在微生物组研究领域，这项研究增进了我们对膳食生物活性化合物如何与特定微生物类群相互作用以产生影响宿主健康的功能性代谢物的理解。 它进一步加深了我们对肥胖人群中微生物多样性、产生短链脂肪酸的细菌以及炎症相关微生物途径的理解。 最后，该研究通过提供转化营养研究的实际案例，有助于教育和学习目标。 它结合了分子营养学、微生物学和行为科学，使其成为培训跨学科公共卫生和生物医学科学学生和从业人员的优秀案例研究。 它促进了使用综合性、基于食物的解决方案解决复杂健康问题所需的系统思维方法。

研究问题

为了指导这项研究，本研究通过以下问题重点了解芒果来源的GT提取物和戊糖乳杆菌补充剂如何影响肥胖个体的肠道微生物群和炎症：

• GTs治疗（无论是否补充戊糖乳杆菌）如何影响肥胖成年人的肠道微生物组成？
• GT和戊糖乳杆菌补充剂对肥胖个体的炎症生物标志物有何影响？
• 肥胖个体之间的遗传变异是否影响没食子单宁的代谢。
• 与单独干预相比，GTs和戊糖乳杆菌的组合在调节与肥胖和炎症相关的特定微生物类群方面是否表现出协同效应？

假设

1. 预计体重指数（BMI）与血浆中GTs及其代谢物浓度以及产热和抗炎活性之间存在负相关。
2. 预计戊糖乳杆菌会增加没食子单宁的有益效果

目的与目标 主要目的 本试点研究的主要目的是研究芒果来源的没食子单宁（GTs）（无论是否补充益生菌戊糖乳杆菌）对肥胖个体肠道微生物群组成和炎症标志物的体外影响。

具体目标

1. 评估肥胖参与者在接受GT提取物治疗（无论是否补充戊糖乳杆菌）后肠道微生物群组成的变化。
2. 评估GTs和戊糖乳杆菌单独及联合使用的抗炎潜力。
3. 通过比较干预组之间的微生物多样性、产生短链脂肪酸的细菌丰度以及炎症标志物变化，确定GTs和戊糖乳杆菌之间的潜在协同效应。

理由 肠道微生物生态紊乱和慢性低度炎症与肥胖密切相关，两者都在代谢紊乱的发生和发展中起作用。 为了有效管理肥胖，必须解决这些相互关联的代谢异常。 芒果是没食子单宁（GTs）的丰富来源，GTs已被证明具有抗炎、代谢调节和益生元样特性。 然而，宿主将其转化为生物活性衍生物的能力对其健康益处至关重要——这种能力根据肠道微生物群的组成而异。

补充戊糖乳杆菌益生菌为解决这一代谢限制提供了一种强有力的方法。 通过增强黏膜屏障功能、调节免疫反应以及可能有助于多酚代谢，戊糖乳杆菌在促进肠道健康方面显示出潜力。 因此，将这种益生菌与富含GT的芒果结合可能会增加系统对有益GT代谢物的暴露。 正如在血浆和脂肪组织样本中所见，微生物调节和增强的代谢物生物利用度的联合作用可能会产生更明显的产热和抗炎效果，尤其是在肥胖人群中。

尽管预期有益处，但必须认识到，补充戊糖乳杆菌后观察到的任何炎症或代谢变化可能不仅仅归因于GT代谢物水平的升高。 益生菌本身可能具有独立的生物学效应，例如改变宿主的免疫系统或直接与引起炎症的细菌竞争。 因此，本研究的目的不是在实用的、综合的环境中识别GT特异性途径，而是探索益生菌补充剂与富含GT的食物之间的功能相互作用。

考虑到对肠道微生物组靶向治疗和个性化营养日益增长的兴趣，这项研究既是必要的也是及时的。 它将提供关于多酚和益生菌之间的相互作用如何影响最易患慢性疾病群体的关键代谢和炎症标志物的基本信息。 最终，研究结果可能会影响旨在通过微生物组意识技术改善肥胖人群健康结果的饮食建议和补充计划。

方法学 研究设计 本研究是一项人体临床试验。 研究设计为随机、双盲、安慰剂对照。 参与者将被要求提供唾液、血液和粪便等人体样本。 该研究已获得Prairie View A&M大学（PVAMU）和德克萨斯农工大学机构审查委员会（IRB）的批准，并将在www.Clinicaltrials.gov上注册。

研究人群 本研究将招募总共20名志愿者，其中15名肥胖者作为干预组的一部分，而5名瘦且健康的个体将作为对照组的一部分。 对于干预组，15名志愿者将被随机分为3组，每组n=5名参与者。 招募将通过分享招募传单在关键区域进行，如沃勒县及周边其他县的杂货店、超市、教堂、社区中心和其他活动中心。 在招募参与者进入研究之前，将询问筛选问题。

仪器 将使用一系列仪器以确保准确的数据收集和分析。 颊细胞将使用Isohelix SK-1 DNA颊拭子收集，生物样本（血浆、尿液和粪便）将在适当条件下储存在-80°C。 炎症和代谢生物标志物将使用多重微珠检测法测量，并在Luminex L200系统和xPONENT软件上进行分析。 基因分型将使用TaqMan检测法进行，以检测选定的SNP变异。 微生物组分析将通过使用Qiagen QIAamp DNA粪便迷你试剂盒提取DNA、在Illumina平台（MiSeq或NovaSeq）上进行测序以及使用QIIME2、SILVA/Greengenes数据库、LEfSe和PICRUSt2进行分析来完成。 没食子单宁代谢物的化学分析将使用HPLC-ESI-MSn在Thermo Finnigan Altis三重四极杆和HPLC-MS高分辨率离子阱上进行。 最后，离体免疫检测将涉及用LPS刺激外周血单个核细胞，并使用xMAP多重检测法定量细胞因子水平。

样本收集 血浆样本将在基线、禁食过夜后的第1周收集。 血浆等分试样将在获得后立即制备并储存在-80°C直至分析。 粪便将在可用时收集并立即进行厌氧处理。 参与者将在基线时使用Isohelix SK-1 DNA颊拭子和Isohelix干燥胶囊收集颊细胞样本。

样本分析 炎症和代谢标志物 将分析血浆样本以评估各种炎症生物标志物的水平。 这些将包括炎症细胞因子，如白细胞介素-10（IL-10）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）；以及心血管标志物C反应蛋白（CRP）。 所有测量将使用多重微珠检测法（Millipore, Billerica, MA）进行。

基因分型 DNA和基因分型特定位点将使用TaqMan基因分型检测法提取，为以下基因提供双等位基因评分：脂肪质量和肥胖相关基因[FTO (rs9939609)]和脂肪酸去饱和酶1 [FADS1 (rs174546)]。

微生物组检测 将从粪便样本中提取微生物DNA，使用Qiagen QIAamp DNA粪便迷你试剂盒。 16S rRNA基因测序（V3-V4区域）将使用Illumina MiSeq平台进行。 为了进行更深入的分析，将考虑使用Illumina NovaSeq平台进行鸟枪法宏基因组测序。 序列数据将使用微生物生态学定量分析（QIIME）2进行处理。 分类学分类将使用SILVA或Greengenes数据库。

多样性指数：

• Alpha多样性将使用Shannon和Chao1指数计算。
• Beta多样性将使用Bray-Curtis和UniFrac距离评估。

差异丰度分析将使用LEfSe进行，预测的微生物功能将通过系统发育调查重建未观察状态（PICRUSt2）使用R studio推断。

化学分析 GT代谢物将通过首先离心去除生物质，然后使用乙酸乙酯提取，以没食子酸乙酯作为内标进行分离。 MS参数将使用预测代谢物的标准品进行优化（如果可用），以识别强度最高的母离子/子离子碎片。 目标代谢物将使用全扫描、SRM（单离子）和MRM（多反应监测）在HPLC-ESI-MSn上使用Thermo Finnigan Altis三重四极杆和内标进行定量。 非目标代谢物或低浓度代谢物将在德克萨斯农工大学代谢组学核心实验室使用HPLC-MS高分辨率离子阱进行识别/定量。

统计分析 所有统计检验将在0.05水平上进行，且为双侧检验。 数据将检查正态性，所有非正态变量将进行log10转换。 分析将基于意向治疗（ITT）原则进行。 使用交叉设计的ANOVA技术，并在必要时辅以等效的Wilcoxon秩和检验。 将测试基线的绝对变化，并基于基线的百分比变化进行次要分析。 主要结果是血浆中炎症生物标志物的变化，因为这一结果适用于瘦和肥胖个体。 所有其他研究结果将视为次要结果。 治疗效果的进一步次要分析将使用基于患者基线特征的协方差分析。 为了保持平衡的实验设计，我们将随机分配一半患者到两个治疗序列中的每一个。 区组随机化将采用混合区组编号，以保护随机化和治疗分配的平衡，消除可能的偏倚，并保持盲法。 每个区组将由一个个体组成。

伦理考虑 在开始招募和数据收集之前，已寻求并获得德克萨斯农工大学和Prairie A&M大学机构审查委员会（IRB）的伦理批准。 这很重要，因为本研究涉及人类受试者，保护他们的权利并保持完全保密至关重要。 为了保持保密性，符合条件的参与者将签署知情同意书。 知情同意书将包含研究概述、将收集的参与者信息以及将收集的生物样本。