Влияние галлотанинов на микробиом кишечника и их воздействие на воспалительные маркеры у лиц с ожирением.

Введение. Предпосылки. Ожирение является серьёзным, распространённым и дорогостоящим хроническим заболеванием. Согласно отчёту Центра по контролю и профилактике заболеваний, более чем у 2 из 5 взрослых в Соединённых Штатах (США) диагностировано ожирение. Проблема ожирения в США демонстрирует тенденцию к росту, так как отчёты показали, что распространённость ожирения среди взрослых в США в возрасте 20 лет и старше с 2017 по 2020 год составила 41,9%, увеличившись с 30,5% в 2000 году. Одновременно распространённость тяжёлого ожирения также возросла с 4,7% до 9,2%. Это означает, что более 100 миллионов взрослых в США живут с ожирением, в то время как более 22 миллионов человек живут с тяжёлым ожирением.

Основной причиной ожирения является аномальное и чрезмерное накопление липидов во многих органах и тканях, особенно в висцеральной или абдоминальной области, включая белую жировую ткань (БЖТ), что называется абдоминальным ожирением. На развитие многочисленных важных неинфекционных заболеваний, таких как сахарный диабет, метаболическая дисфункция-ассоциированная жировая болезнь печени (МАЖБП), сердечно-сосудистые заболевания, гипертония и почечные расстройства, существенно влияет этот тип ожирения. Предполагается, что одним из основных патогенных механизмов при ожирении является нарушение адипогенеза, то есть процесса дифференцировки адипоцитов.

Дальнейшими характеристиками нездорового ремоделирования БЖТ являются повышенный окислительный стресс и воспаление. Гистологические короноподобные структуры (КПС) образуются, когда увеличенные адипоциты высвобождают хемокины, которые привлекают иммунные клетки, главным образом макрофаги, для окружения адипоцитов. Запуская провоспалительные регуляторы, такие как ядерный фактор каппа-B (NF-κB), которые, в свою очередь, усиливают выработку воспалительных генов и подавляют противовоспалительные регуляторы, такие как интерлейкин 10 (IL10), этот механизм усугубляет гипервоспалительное состояние. Кроме того, окислительный стресс, индуцированный активными формами кислорода (АФК), может подавлять антиоксидантную регуляцию, особенно опосредованную ядерным фактором, связанным с эритроидным фактором 2 (NFE2L2/NRF2), экспрессию антиоксидантных генов.

Метаболические проблемы, такие как инсулинорезистентность, дислипидемия и нарушенный адипогенез, вызваны как окислительным стрессом, так и воспалением. Следовательно, методы предотвращения гипертрофии адипоцитов, улучшения адипогенеза для создания нормальных адипоцитов, обратного вредного ремоделирования БЖТ, а также ограничения окислительного стресса и воспаления могут быть эффективными способами борьбы с ожирением и метаболическим синдромом.

Использование диетического вмешательства для профилактики и лечения ожирения применяется в течение многих лет и исследователями описывается как фундаментальное. Потребление пищи или натуральных продуктов, включая фрукты и овощи, с низкой энергетической плотностью и высоким содержанием биологически активных химических веществ, было предложено в качестве способа управления ожирением и связанными с ним проблемами. Известно, что съедобные дикорастущие фрукты и овощи из разных регионов содержат разнообразные биологически активные вещества, включая фенольные соединения, которые могут обладать противовоспалительным, антиоксидантным и метаболически-регулирующим действием. Экстракты фруктов, содержащие флавоноиды и полифенолы, такие как кверцетин, катехин и рутин, продемонстрировали положительное влияние на маркеры метаболической дисфункции. В моделях ожирения на животных они включают уменьшение количества адипоцитов и макрофагов, накопления липидов, висцеральной жировой ткани, а также маркеров воспаления и окислительного стресса.

Высокая концентрация фенольных веществ (таких как галловая кислота, галлотанин, галлоилгликозиды и флавоноиды) в манго (Mangifera indica L.) предполагает, что они обладают сильным антиоксидантным и противовоспалительным потенциалом, что указывает на то, что полифенолы, полученные из манго, могут способствовать профилактике хронических заболеваний, связанных с ожирением. В доклинических исследованиях потребление манго снижало ожирение и улучшало липидный профиль, толерантность к глюкозе и экспрессию воспалительных цитокинов у крыс, получавших диету с высоким содержанием жиров. Согласно модели in vitro с использованием клеток-преадипоцитов 3T3-L1, ингибирование адипогенеза экстрактами манго, скорее всего, связано с уменьшением митотического клонального роста, критической стадии начала дифференцировки адипоцитов.

Клинические исследования на людях также показали, что добавление манго снижает уровень глюкозы в крови у людей с ожирением, у лиц с диабетом 2 типа, а также улучшает липидный профиль и антиоксидантную способность у здоровых взрослых. У людей с избыточным весом и гипергликемией было продемонстрировано, что натуральные фитохимические вещества из плодов манго и их метаболиты, такие как мангиферин, повышают уровень ЛПВП и снижают уровень триглицеридов и свободных жирных кислот. Согласно этим результатам, полифенолы, экстрагированные из манго, обладают сильными противовоспалительными и антилипогенными свойствами, которые могут помочь в профилактике хронических расстройств, связанных с ожирением.

Постановка проблемы. В глобальном масштабе ожирение стало эпидемией сложных, многовариантных метаболических проблем, которые вызывают увеличение распространённости хронических состояний, таких как диабет 2 типа, болезни сердца и некоторые виды рака. Изменённая микробная экология кишечника, или дисбиоз, и стойкое слабовыраженное воспалительное состояние являются ключевыми компонентами патофизиологии ожирения. Снижение популяций полезных бактерий, продуцирующих короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК), увеличение провоспалительных таксонов и снижение микробного разнообразия являются общими характеристиками этого дисбиотического состояния, которые могут способствовать поддержанию метаболической дисфункции и системного воспаления. Для снижения воспаления и восстановления микробного баланса у людей с ожирением растёт интерес к разработке диетических вмешательств.

Полифенолы хорошо известны своими противовоспалительными, антиоксидантными и пребиотикоподобными свойствами, особенно галлотанины (ГТ), которые присутствуют в манго. После расщепления кишечными микроорганизмами ГТ могут способствовать росту полезных бактерий и ингибировать рост вредных, однако точные эффекты могут зависеть от состава микробиоты каждого конкретного человека. Аналогично, Lactiplantibacillus pentosus улучшает целостность слизистой оболочки кишечника и модулирует иммунную функцию, хотя его эффекты в изоляции часто неоднозначны.

Lactiplantibacillus pentosus LPG1 (далее именуемый LPG1) — это ферментный препарат, полученный из биоплёнок столовых оливок, который продемонстрировал пробиотические свойства в исследованиях in vitro и in vivo (на мышиной модели). Этот штамм обладает противовоспалительными и фитазными свойствами, может снижать уровень холестерина, ингибирует пищевые инфекции, прикрепляется к клеткам Caco-2 и не обладает гемолитической активностью, среди других характеристик. Кроме того, клинические исследования продемонстрировали его безопасность для людей. В этом отношении недавнее исследование обнаружило, что геном L. pentosus LPG1 не содержит генов устойчивости к антибиотикам и вирулентности, но содержит множество потенциально полезных бактерий, бактериоцинов, генов кластера продукции экзополисахаридов, фолиевой кислоты и пищеварительных ферментов, способных расщеплять сложные углеводы, такие как галактоза, гликоген, крахмал, целлюлоза или ксилан.

Пробиотическая способность штаммов Lactiplantibacillus уже изучалась в клинических испытаниях на людях. Котани исследовал способность L. pentosus b240, первоначально выделенного из ферментированных чайных листьев, стимулировать секрецию иммуноглобулина А в слюне у пожилых людей. Ван исследовал влияние перорального приёма Lactiplantibacillus pentosus Lp-8 на состав фекальной микробиоты. de Vos изучал эффекты перорального приёма нескольких штаммов L. pentosus на иммунный ответ, тогда как Рудзки исследовал влияние перорального приёма L. pentosus 299 на когнитивные способности у пациентов с депрессией. Недавно Ан исследовал эффекты штамма L. pentosus, выделенного из кимчи, на детей с аллерген-чувствительным атопическим дерматитом и показал улучшение симптомов у участников.

Хотя это не было изучено эмпирически у людей с ожирением, возможность синергетической регуляции метаболитов, полученных из микроорганизмов, или ослабления воспалительных показателей особенно интригует. Это пилотное исследование направлено на восполнение этого пробела путём оценки эффектов экстракта ГТ, с добавлением L. pentosus или без него, на микробиоту кишечника и воспаление у взрослых с ожирением in vitro. Результаты прольют свет на то, могут ли комбинации полифенол-пробиотик обеспечивать больше преимуществ для здоровья, чем монотерапия, и будут направлять будущие подходы в персонализированном питании и управлении ожирением.

Значимость исследования. В настоящее время считается, что хроническое слабовыраженное воспаление и нарушенная микробная экология кишечника являются ключевыми факторами в развитии и прогрессировании ожирения и связанных с ним метаболических заболеваний. Эффективное управление этими взаимосвязанными дисфункциями зависит от прогресса в усилиях по профилактике и лечению ожирения. Популярный тропический фрукт, манго (Mangifera indica L.), особенно богат галлотанинами (ГТ), подклассом гидролизуемых полифенолов, которые, как было показано, обладают противовоспалительными, антиоксидантными, метаболически-регулирующими и пребиотикоподобными свойствами. Однако биотрансформация ГТ в усваиваемые, способствующие укреплению здоровья метаболиты кишечными микробами является основным фактором их биоактивности. Потенциальные преимущества полифенолов, полученных из манго, не достигаются последовательно среди популяций, поскольку микробный состав различается у разных людей.

Добавление хорошо охарактеризованного пробиотика Lactiplantibacillus pentosus представляет собой жизнеспособный способ решения проблемы гетерогенности в метаболизме полифенолов. Этот пробиотик может помочь расщеплять сложные фенольные химические вещества, такие как ГТ, улучшать целостность кишечного барьера и регулировать иммунные ответы. L. pentosus может работать в тандеме с ГТ для увеличения биодоступности полезных метаболитов и оказания положительного воздействия на микробную экологию кишечника. Это может затем усилить термогенные и противовоспалительные эффекты, которые могут проявиться в виде улучшения здоровья кишечника, снижения уровня воспалительных биомаркеров и улучшения метаболических профилей, особенно у людей с ожирением.

Это открытие имеет важные последствия для ряда областей. Науки о питании, оценивая комбинированный подход полифенол-пробиотик, предназначенный для изменения метаболизма хозяина через микробиоту кишечника, продвигают растущую область функциональных продуктов питания и нутрицевтиков. Оно предоставляет информацию для поддержки индивидуализированных диетических терапий при ожирении на основе микробного состава и индивидуального метаболического ответа, что соответствует принципам прецизионного питания. С точки зрения общественного здравоохранения, результаты могут помочь в разработке основанных на пище масштабируемых методов снижения риска хронических заболеваний в уязвимых группах. Ожирение остаётся значительным фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний, диабета 2 типа и некоторых видов рака. Поэтому поиск естественных, культурно приемлемых и легко доступных диетических вмешательств, которые улучшают метаболические и воспалительные исходы, может быть экономичным способом профилактики и контроля заболеваний, особенно в неблагополучных условиях.

Для исследований хронических заболеваний работа даёт механистическое понимание роли диетических полифенолов и пробиотиков в влиянии на системное воспаление и метаболическую дисфункцию. Это может помочь в руководстве будущими клиническими испытаниями, направленными на включение методов лечения, нацеленных на микробиом, в стандартные модели ухода при ожирении и других неинфекционных заболеваниях. Исследование также имеет значение для фруктовой и сельскохозяйственной отраслей, особенно в продвижении функциональных свойств манго и других фруктов, богатых полифенолами. В случае успеха это исследование повысит рыночную привлекательность манго как продукта, способствующего укреплению здоровья, увеличит спрос и будет стимулировать разработку продуктов питания, обогащённых полифенолами. Кроме того, результаты могут информировать сельскохозяйственные практики, направленные на увеличение содержания биоактивных соединений в плодовых культурах.

Помимо манго, это исследование закладывает основу для изучения аналогичных взаимодействий в других фруктах, богатых полифенолами, таких как сумах, расширяя актуальность исследования для различных культурных и географических диетических ситуаций. В области исследований микробиома это исследование углубляет наше понимание того, как диетические биоактивные соединения взаимодействуют с определёнными микробными таксонами для производства функциональных метаболитов, влияющих на здоровье хозяина. Оно углубляет наше понимание микробного разнообразия, бактерий, продуцирующих КЦЖК, и воспалительных микробных путей у людей с ожирением. Наконец, исследование способствует образовательным и учебным целям, предоставляя практический пример трансляционных исследований в области питания. Оно сочетает молекулярное питание, микробиологию и поведенческие науки, что делает его отличным примером для обучения студентов и практикующих специалистов в междисциплинарных областях общественного здравоохранения и биомедицинских наук. Оно способствует системному мышлению, необходимому для решения сложных проблем здоровья с помощью интегративных, основанных на пище решений.

Исследовательские вопросы

Для руководства этим исследованием, исследование фокусируется на понимании того, как экстракт ГТ из манго и добавление Lactiplantibacillus pentosus влияют на микробиоту кишечника и воспаление у людей с ожирением, через следующие вопросы:

• Как лечение ГТ, с добавлением L. pentosus или без него, влияет на состав микробиоты кишечника у взрослых с ожирением?
• Каково влияние добавок ГТ и L. pentosus на воспалительные биомаркеры у людей с ожирением?
• Объясняет ли генетическая вариация среди людей с ожирением метаболизм галлотанинов.
• Проявляет ли комбинация ГТ и L. pentosus синергетические эффекты в модуляции специфических микробных таксонов, связанных с ожирением и воспалением, по сравнению с любым вмешательством по отдельности?

Гипотеза

1. Ожидается, что существует обратная корреляция между индексом массы тела (ИМТ) и концентрацией ГТ и метаболитов в плазме, а также термогенной и противовоспалительной активностью.
2. Ожидается, что L. pentosus усилит полезные эффекты галлотанинов

Цель и задачи. Основная цель. Основной целью этого пилотного исследования является изучение эффектов галлотанинов (ГТ) из манго, с добавлением пробиотика L. pentosus или без него, на состав микробиоты кишечника и воспалительные маркеры у людей с ожирением in vitro.

Конкретные задачи

1. Оценить изменения в составе микробиоты кишечника у участников с ожирением после лечения экстрактом ГТ, с добавлением L. pentosus или без него.
2. Оценить противовоспалительный потенциал ГТ и L. pentosus по отдельности и в комбинации.
3. Выявить потенциальные синергетические эффекты между ГТ и L. pentosus путём сравнения микробного разнообразия, обилия бактерий, продуцирующих КЦЖК, и изменений воспалительных маркеров в различных группах вмешательства.

Обоснование. Нарушенная микробная экология кишечника и хроническое слабовыраженное воспаление тесно связаны с ожирением, и оба играют роль в развитии и прогрессировании метаболических расстройств. Для эффективного управления ожирением крайне важно устранить эти взаимосвязанные метаболические аномалии. Манго являются богатым источником галлотанинов (ГТ), которые, как было доказано, обладают противовоспалительными, метаболически-регулирующими и пребиотикоподобными качествами. Однако способность хозяина преобразовывать их в биоактивные производные — способность, которая варьируется в зависимости от состава микробиоты кишечника — имеет решающее значение для их преимуществ для здоровья.

Добавление пробиотика Lactiplantibacillus pentosus представляет собой сильный подход к преодолению этого метаболического ограничения. Улучшая функцию слизистого барьера, регулируя иммунные ответы и, возможно, способствуя метаболизму полифенолов, L. pentosus показал перспективность в укреплении здоровья кишечника. Следовательно, сочетание этого пробиотика с манго, богатым ГТ, может увеличить системное воздействие полезных метаболитов ГТ. Как видно в образцах плазмы и жировой ткани, комбинированное действие микробной регуляции и повышенной биодоступности метаболитов может производить более заметные термогенные и противовоспалительные эффекты, особенно у людей с ожирением.

Несмотря на ожидаемые преимущества, важно признать, что любые изменения в воспалении или метаболизме, наблюдаемые после приёма добавок L. pentosus, могут быть не только из-за повышенного уровня метаболитов ГТ. Сам пробиотик может оказывать биологические эффекты самостоятельно, такие как модификация иммунной системы хозяина или прямая конкуренция с бактериями, вызывающими воспаление. Поэтому цель этого исследования — изучить функциональные взаимодействия между добавлением пробиотиков и пищей, богатой ГТ, в практической, интегративной обстановке, а не выявить специфические пути ГТ.

Учитывая растущий интерес к терапиям, нацеленным на микробиом кишечника, и персонализированному питанию, это исследование является как необходимым, так и своевременным. Оно предоставит фундаментальную информацию о том, как взаимодействия между полифенолами и пробиотиками влияют на ключевые метаболические и воспалительные маркеры в группах, наиболее подверженных риску хронических заболеваний. В конечном итоге, результаты могут повлиять на диетические рекомендации и планы приёма добавок, предназначенные для улучшения результатов здоровья у людей с ожирением с использованием методов, учитывающих микробиом.

Методология. Дизайн исследования. Это исследование является клиническим испытанием на людях. Дизайн исследования — рандомизированный, двойной слепой, плацебо-контролируемый. Участников попросят предоставить образцы человека, такие как слюна, кровь и стул. Исследование было одобрено Институциональными наблюдательными советами (IRB) Университета Prairie View A&M (PVAMU) и Техасского университета A&M и будет зарегистрировано на сайте www.Clinicaltrials.gov.

Исследуемая популяция. Всего для этого исследования будет набрано 20 добровольцев, из которых 15 человек с ожирением составят интервенционную группу, а 5 худых и здоровых людей составят контрольную группу. Для интервенционной группы 15 добровольцев будут рандомизированы в 3 группы, по n=5 участников в каждой группе. Набор будет осуществляться путём распространения листовок для набора в ключевых местах, таких как продуктовые магазины, супермаркеты, церкви, общественные центры и другие центры мероприятий в округе Уоллер и других соседних округах. Участникам будут заданы скрининговые вопросы до их включения в исследование.

Инструменты. Будет использован ряд инструментов для обеспечения точного сбора и анализа данных. Буккальные клетки будут собираться с помощью буккальных тампонов Isohelix SK-1 для ДНК, а биологические образцы (плазма, моча и стул) будут храниться при -80°C в соответствующих условиях. Воспалительные и метаболические биомаркеры будут измеряться с помощью мультиплексного анализа на основе шариков с анализом на системе Luminex L200 и программном обеспечении xPONENT. Генотипирование будет проводиться с помощью анализов TaqMan для обнаружения выбранных вариантов SNP. Профилирование микробиома будет выполняться путём экстракции ДНК с использованием набора Qiagen QIAamp DNA Stool Mini Kit, секвенирования на платформах Illumina (MiSeq или NovaSeq) и анализа с помощью QIIME2, баз данных SILVA/Greengenes, LEfSe и PICRUSt2. Химический анализ метаболитов галлотанина будет проводиться с использованием HPLC-ESI-MSn на тройном квадруполе Thermo Finnigan Altis и ионной ловушки высокого разрешения HPLC-MS. Наконец, экс виво иммунные анализы будут включать стимуляцию мононуклеарных клеток периферической крови ЛПС, а уровни цитокинов будут количественно определяться с помощью xMAP Multiplex Assay.

Сбор образцов. Образцы плазмы будут собираться на исходном уровне, на 1 неделе после ночного голодания. Аликвоты плазмы будут готовиться сразу после их получения и храниться при -80°C до анализа. Стул будет собираться по мере возможности и немедленно анаэробно обрабатываться. Участники будут собирать образцы буккальных клеток на исходном уровне с использованием буккальных тампонов Isohelix SK-1 для ДНК и сухих капсул Isohelix.

Анализ образцов. Воспалительные и метаболические маркеры. Образцы плазмы крови будут анализироваться для оценки уровней различных воспалительных биомаркеров. Они будут включать воспалительные цитокины, такие как интерлейкин-10 (IL-10), моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 (MCP-1); и сердечно-сосудистый маркер C-реактивный белок (CRP). Все измерения будут выполняться с помощью мультиплексного анализа на основе шариков (Millipore, Билерика, Массачусетс).

Генотипирование. ДНК и генотипированные специфические локусы будут экстрагироваться с использованием анализов генотипирования TaqMan для предоставления биаллельного скоринга однонуклеотидных полиморфизмов для следующих генов: ассоциированный с массой жира и ожирением [FTO (rs9939609)] и десатураза жирных кислот 1 [FADS1 (rs174546)].

Анализ микробиома. Микробная ДНК будет экстрагироваться из образцов стула с использованием набора Qiagen QIAamp DNA Stool Mini Kit. Секвенирование гена 16S рРНК (регион V3-V4) будет проводиться с использованием платформы Illumina MiSeq. Для более глубокого анализа будет рассматриваться метагеномное секвенирование дробовиком с использованием платформы Illumina NovaSeq. Данные последовательностей будут обрабатываться с помощью Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME)2. Таксономическая классификация будет использовать базы данных SILVA или Greengenes.

Индексы разнообразия:

• Альфа-разнообразие будет рассчитываться с использованием индексов Шеннона и Чао1.
• Бета-разнообразие будет оцениваться с использованием расстояний Брея-Кёртиса и UniFrac.

Анализ дифференциальной обилия будет выполняться с использованием LEfSe, а предсказанные микробные функции будут выводиться через Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt2) с использованием R studio.

Химический анализ. Метаболиты ГТ будут изолированы путём первоначального центрифугирования для удаления биомассы, а затем экстрагированы этилацетатом с использованием этилгаллата в качестве внутреннего стандарта. Параметры МС будут оптимизированы с использованием стандартов предсказанных метаболитов, когда они доступны, для идентификации родительских/дочерних фрагментов с наибольшей интенсивностью. Целевые метаболиты будут количественно определяться с использованием полного сканирования, SRM (одиночного иона) и MRM (множественного мониторинга реакций) на HPLC-ESI-MSn с использованием тройного квадрупольного масс-спектрометра Thermo Finnigan Altis с использованием внутренних стандартов. Ненаправленные метаболиты или метаболиты низкой концентрации будут идентифицированы/количественно определены в лаборатории метаболомики Техасского университета A&M с использованием ионной ловушки высокого разрешения HPLC-MS

Статистический анализ. Все статистические тесты будут выполняться на уровне 0,05 и будут двусторонними. Данные будут проверяться на нормальность, и все ненормальные переменные будут преобразованы log10. Анализ будет проводиться на основе намерения лечить (ITT). Техника ANOVA для перекрёстных дизайнов и, при необходимости, дополненная эквивалентным тестом рангов Уилкоксона. Будет проверено абсолютное изменение от исходного уровня, и вторичные анализы будут выполнены на основе процентного изменения от исходного уровня. Основным исходом является изменение воспалительных биомаркеров в плазме, поскольку этот исход применим как к худым, так и к людям с ожирением. Все другие исследуемые исходы будут рассматриваться как вторичные исходы. Дальнейший вторичный анализ эффектов лечения будет использовать ковариационный анализ на основе исходных характеристик пациентов. Мы случайным образом назначим половину пациентов каждой из двух последовательностей лечения для поддержания сбалансированного экспериментального дизайна. Блочная рандомизация будет с использованием смешанных номеров блоков для защиты рандомизации и баланса в назначении лечения, устранения возможных смещений и сохранения ослепления. Каждый блок будет состоять из одного человека.

Этические соображения. Этическое одобрение было запрошено и получено от институционального наблюдательного совета (IRB) Техасского университета A&M и Университета Prairie A&M до начала набора и сбора данных. Это важно, поскольку это исследование включает человеческий субъект, и важно защитить их права, а также сохранить полную конфиденциальность. Для сохранения конфиденциальности квалифицированные участники исследования подпишут форму согласия. Форма согласия будет содержать обзор исследования, информацию об участнике, которая будет собираться, и биологические образцы, которые будут собираться.