Effets des gallotanins sur le microbiome intestinal et comment cela affecte les marqueurs inflammatoires chez les individus obèses.

Introduction Contexte L'obésité est une maladie chronique grave, courante et coûteuse. Selon un rapport du Centre de contrôle et de prévention des maladies, plus de 2 adultes sur 5 aux États-Unis (États-Unis) vivent avec l'obésité. La problématique de l'obésité aux États-Unis est une tendance croissante, car des rapports ont montré que la prévalence de l'obésité chez les adultes américains âgés de 20 ans et plus de 2017 à 2020 était de 41,9 %, en hausse par rapport à 30,5 % en 2000. Simultanément, la prévalence de l'obésité sévère est également passée de 4,7 % à 9,2 %. Cela signifie que plus de 100 millions d'adultes aux États-Unis vivent avec l'obésité, tandis que plus de 22 millions de personnes vivent avec une obésité sévère.

La cause principale de l'obésité est l'accumulation anormale et excessive de lipides dans de nombreux organes et tissus, en particulier dans la zone viscérale ou abdominale, y compris le tissu adipeux blanc (TAB), ce que l'on appelle l'obésité abdominale. De nombreuses maladies non transmissibles importantes, telles que le diabète sucré, la maladie du foie gras métabolique (MAFLD), les maladies cardiovasculaires, l'hypertension et les troubles rénaux, sont significativement influencées par ce type d'obésité. L'un des principaux mécanismes pathogènes de l'obésité serait l'altération de l'adipogenèse, ou le processus de différenciation des adipocytes.

L'augmentation du stress oxydatif et de l'inflammation sont d'autres caractéristiques du remodelage malsain du TAB. Des structures histologiques en couronne (CLS) se forment lorsque les adipocytes hypertrophiés libèrent des chimiokines qui attirent les cellules immunitaires, principalement les macrophages, pour entourer les adipocytes. En déclenchant des régulateurs pro-inflammatoires comme le facteur nucléaire kappa B (NF-κB), qui à son tour stimule la production de gènes inflammatoires et surpasse les régulateurs anti-inflammatoires comme l'interleukine 10 (IL-10), ce mécanisme intensifie l'état hyperinflammatoire. De plus, le stress oxydatif induit par les espèces réactives de l'oxygène (ROS) peut surpasser la régulation antioxydante, en particulier l'expression médiée par le facteur nucléaire érythroïde 2 apparenté 2 (NFE2L2/NRF2) des gènes antioxydants.

Les problèmes métaboliques, tels que la résistance à l'insuline, la dyslipidémie et l'adipogenèse perturbée, sont causés à la fois par le stress oxydatif et l'inflammation. Par conséquent, les méthodes pour éviter l'hypertrophie des adipocytes, améliorer l'adipogenèse pour créer des adipocytes normaux, inverser le remodelage nocif du TAB et limiter le stress oxydatif et l'inflammation peuvent être des moyens efficaces pour lutter contre l'obésité et le syndrome métabolique.

L'utilisation de l'intervention diététique pour la prévention et la gestion de l'obésité est utilisée depuis de nombreuses années et a été décrite par les chercheurs comme fondamentale. Consommer des repas ou des produits naturels, y compris des fruits et légumes, qui sont faibles en densité énergétique et riches en substances bioactives, a été suggéré comme un moyen de gérer l'obésité et ses problèmes associés. Les fruits et légumes sauvages comestibles de différentes régions sont connus pour contenir une variété de substances bioactives, y compris des composés phénoliques, qui peuvent avoir des effets anti-inflammatoires, antioxydants et de régulation métabolique. Les extraits de fruits qui contiennent des flavonoïdes et des polyphénols, comme la quercétine, la catéchine et la rutine, ont démontré des effets bénéfiques sur les marqueurs de dysfonctionnement métabolique. Dans les modèles animaux d'obésité, ils incluent des diminutions des adipocytes et des macrophages, de l'accumulation de lipides, du tissu adipeux viscéral, et des marqueurs d'inflammation et de stress oxydatif.

La forte concentration de substances phénoliques (comme l'acide gallique, la gallotannine, les galloyl glycosides et les flavonoïdes) dans les mangues (Mangifera indica L.) suggère qu'elles ont un fort potentiel antioxydant et anti-inflammatoire, indiquant que les polyphénols issus des mangues peuvent aider à la prévention des maladies chroniques liées à l'obésité. La consommation de mangue a diminué l'obésité et amélioré les profils lipidiques, la tolérance au glucose et les expressions de cytokines inflammatoires chez des rats soumis à un régime riche en graisses dans des recherches précliniques. La réduction de la croissance clonale mitotique, une étape cruciale dans le début de la différenciation des adipocytes, est très probablement liée à l'inhibition de l'adipogenèse par les extraits de mangue, selon un modèle in vitro utilisant des cellules préadipocytaires 3T3-L1.

Les investigations cliniques humaines ont également montré que la supplémentation en mangue abaisse la glycémie chez les personnes obèses, les individus atteints de diabète de type 2, et les profils lipidiques et la capacité antioxydante des adultes en bonne santé. Chez les personnes en surpoids avec hyperglycémie, les phytochimiques naturels des fruits de mangue et leurs métabolites, comme la mangiférine, ont démontré augmenter les niveaux de HDL et abaisser les niveaux de triglycérides et d'acides gras libres. Selon ces résultats, les polyphénols extraits des mangues ont de fortes propriétés anti-inflammatoires et anti-lipogéniques qui peuvent aider à prévenir les troubles chroniques liés à l'obésité.

Problématique À l'échelle mondiale, l'obésité est devenue une épidémie de problèmes métaboliques complexes et multivariés qui provoquent une augmentation de la prévalence de conditions chroniques comme le diabète de type 2, les maladies cardiaques et plusieurs types de cancer. Une écologie microbienne intestinale altérée, ou dysbiose, et un état inflammatoire persistant de bas grade sont des composants clés de la physiopathologie de l'obésité. Des populations réduites de bactéries bénéfiques qui produisent des acides gras à chaîne courte (AGCC), une augmentation des taxons pro-inflammatoires et une diminution de la diversité microbienne sont des caractéristiques communes de cette condition dysbiotique, qui peuvent toutes contribuer au maintien de la dysfonction métabolique et de l'inflammation systémique. Pour réduire l'inflammation et restaurer l'équilibre microbien chez les personnes obèses, il y a un intérêt croissant à créer des interventions diététiques.

Les polyphénols sont bien connus pour leurs propriétés anti-inflammatoires, antioxydantes et prébiotiques, en particulier les gallotannins (GT), qui sont présents dans les mangues. Après avoir été décomposés par les micro-organismes intestinaux, les GT peuvent favoriser la croissance de bonnes bactéries et inhiber la croissance de mauvaises bactéries, bien que les effets exacts puissent dépendre de la composition du microbiote de chaque individu. De même, Lactiplantibacillus pentosus améliore l'intégrité de la muqueuse intestinale et module la fonction immunitaire, bien que ses effets isolés soient souvent incohérents.

Lactiplantibacillus pentosus LPG1 (désormais appelé LPG1) est un ferment dérivé de biofilms d'olives de table qui a démontré des propriétés probiotiques dans des études in vitro et in vivo (modèle murin). Cette souche possède des propriétés anti-inflammatoires et phytasiques, peut abaisser les niveaux de cholestérol, inhibe les infections d'origine alimentaire, s'attache aux cellules Caco-2 et n'a pas d'activité hémolytique, entre autres caractéristiques. De plus, des investigations cliniques ont démontré sa sécurité chez les personnes. À cet égard, une étude récente a découvert que le génome de L. pentosus LPG1 manque de gènes de résistance aux antibiotiques et de virulence tout en contenant de nombreuses bactéries potentiellement bénéfiques, des bactériocines, des exopolysaccharides, des gènes de cluster de production de folate et des enzymes digestives capables de décomposer des glucides complexes comme le galactose, le glycogène, l'amidon, la cellulose ou le xylane.

La capacité probiotique des souches de Lactiplantibacillus a déjà été étudiée dans des essais cliniques humains. Kotani a étudié la capacité de L. pentosus b240, initialement isolé à partir de feuilles de thé fermentées, à stimuler la sécrétion d'immunoglobuline A salivaire chez les personnes âgées. Wang a étudié l'impact de l'ingestion orale de Lactiplantibacillus pentosus Lp-8 sur la composition du microbiote fécal. de Vos a étudié les effets de l'ingestion orale de plusieurs souches de L. pentosus sur la réponse immunitaire, tandis que Rudzki a étudié l'effet de l'ingestion orale de L. pentosus 299 sur les capacités cognitives des patients déprimés. Récemment, Ahn a étudié les effets d'une souche de L. pentosus isolée à partir de kimchi, sur des enfants atteints de dermatite atopique sensible aux allergènes et a montré une amélioration des symptômes chez les participants.

Bien que cela n'ait pas été exploré empiriquement chez les personnes obèses, la possibilité d'une régulation synergique des métabolites obtenus à partir de micro-organismes ou d'une atténuation des indicateurs inflammatoires est particulièrement intrigante. En évaluant les effets de l'extrait de GT, avec ou sans supplémentation en L. pentosus, sur le microbiote intestinal et l'inflammation chez les adultes obèses in vitro, cette étude pilote vise à combler cette lacune. Les résultats guideront les approches futures en nutrition personnalisée et gestion de l'obésité en éclairant si les combinaisons polyphénol-probiotique peuvent offrir plus d'avantages pour la santé que la thérapie à agent unique.

Signification de l'étude L'inflammation chronique de bas grade et l'écologie microbienne intestinale perturbée sont maintenant comprises comme des facteurs clés dans le développement et la progression de l'obésité et des maladies métaboliques associées. L'avancement des efforts de prévention et de traitement de l'obésité dépend de la gestion efficace de ces dysfonctions interconnectées. Un fruit tropical populaire, les mangues (Mangifera indica L.) sont particulièrement riches en gallotannins (GT), une sous-classe de polyphénols hydrolysables qui ont démontré avoir des propriétés anti-inflammatoires, antioxydantes, de régulation métabolique et prébiotiques. Cependant, la biotransformation des GT en métabolites absorbables et bénéfiques pour la santé par les microbes intestinaux est un facteur majeur de leur bioactivité. Les avantages potentiels des polyphénols générés à partir de mangues ne sont pas systématiquement atteints à travers les populations car la composition microbienne diffère entre les individus.

La supplémentation avec le probiotique bien caractérisé Lactiplantibacillus pentosus présente une manière viable de s'attaquer à l'hétérogénéité du métabolisme des polyphénols. Ce probiotique peut aider à décomposer les composés phénoliques complexes comme les GT, améliorer l'intégrité de la barrière intestinale et réguler les réponses immunologiques. L. pentosus peut travailler en tandem avec les GT pour augmenter la biodisponibilité des métabolites avantageux et avoir un bon impact sur l'écologie microbienne intestinale. Cela pourrait alors intensifier les effets thermogéniques et anti-inflammatoires, qui pourraient se manifester par une meilleure santé intestinale, des niveaux plus bas de biomarqueurs inflammatoires et des profils métaboliques améliorés, en particulier chez les personnes obèses.

Cette découverte a des ramifications importantes pour un certain nombre de domaines. En évaluant une approche combinée polyphénol-probiotique conçue pour modifier le métabolisme de l'hôte via le microbiote intestinal, la science de la nutrition fait avancer le domaine croissant des aliments fonctionnels et des nutraceutiques. Elle fournit des informations pour soutenir les thérapies diététiques individualisées pour l'obésité basées sur la composition microbienne et la réponse métabolique individuelle, ce qui est cohérent avec les principes de la nutrition de précision. Du point de vue de la santé publique, les résultats peuvent aider à développer des méthodes basées sur l'alimentation et évolutives pour réduire le risque de maladies chroniques dans les groupes sensibles. L'obésité reste un facteur de risque significatif pour les maladies cardiovasculaires, le diabète de type 2 et certains types de cancer. Par conséquent, trouver des interventions diététiques d'origine naturelle, culturellement acceptées et facilement accessibles qui améliorent les résultats métaboliques et inflammatoires peut être une manière économique de prévenir et de contrôler les maladies, en particulier dans les milieux défavorisés.

Pour la recherche sur les maladies chroniques, le travail fournit des informations mécanistiques sur le rôle des polyphénols alimentaires et des probiotiques dans l'influence de l'inflammation systémique et de la dysfonction métabolique. Il pourrait aider à guider les futurs essais cliniques visant à incorporer des traitements ciblant le microbiome dans les modèles de soins standards pour l'obésité et d'autres maladies non transmissibles. L'étude a également des implications pour les industries fruitières et agricoles, en particulier pour promouvoir les propriétés fonctionnelles des mangues et d'autres fruits riches en polyphénols. Si elle réussit, cette étude augmentera la commercialisation des mangues en tant qu'aliment favorisant la santé, stimulera la demande et encouragera le développement de produits alimentaires enrichis en polyphénols. De plus, les résultats peuvent informer les pratiques agricoles visant à augmenter la teneur en composés bioactifs dans les cultures fruitières.

Au-delà des mangues, cette étude jette les bases pour étudier des interactions comparables dans d'autres fruits riches en polyphénols, comme le sumac, élargissant la pertinence de l'étude à diverses situations diététiques culturelles et géographiques. Dans le domaine de la recherche sur le microbiome, cette étude fait avancer notre compréhension de la façon dont les composés bioactifs alimentaires interagissent avec des taxons microbiens spécifiques pour produire des métabolites fonctionnels qui affectent la santé de l'hôte. Elle approfondit notre compréhension de la diversité microbienne, des bactéries productrices d'AGCC et des voies microbiennes liées à l'inflammation chez les personnes obèses. Enfin, l'étude contribue aux objectifs éducatifs et d'apprentissage en fournissant un exemple pratique de recherche nutritionnelle translationnelle. Elle combine la nutrition moléculaire, la microbiologie et la science comportementale, en faisant une excellente étude de cas pour former les étudiants et praticiens en sciences de la santé publique et biomédicales interdisciplinaires. Elle promeut l'approche systémique requise pour résoudre les préoccupations sanitaires complexes en utilisant des solutions intégratives basées sur l'alimentation.

Questions de recherche

Pour guider cette investigation, l'étude se concentre sur la compréhension de la façon dont l'extrait de GT de mangue et la supplémentation en Lactiplantibacillus pentosus affectent le microbiote intestinal et l'inflammation chez les individus obèses à travers les questions suivantes :

• Comment le traitement avec les GT, avec ou sans L. pentosus, influence-t-il la composition microbienne intestinale chez les adultes obèses ?
• Quel est l'impact de la supplémentation en GT et L. pentosus sur les biomarqueurs inflammatoires chez les individus obèses ?
• La variation génétique entre les individus obèses explique-t-elle le métabolisme des gallotannins.
• La combinaison de GT et L. pentosus présente-t-elle des effets synergiques dans la modulation de taxons microbiens spécifiques associés à l'obésité et à l'inflammation par rapport à chaque intervention seule ?

Hypothèse

1. Il est attendu qu'il y ait une corrélation inverse entre l'indice de masse corporelle (IMC) et la concentration plasmatique de GT et métabolites, ainsi que les activités thermogéniques et anti-inflammatoires.
2. L. pentosus devrait augmenter les effets bénéfiques des gallotannins

Objectif et objectifs Objectif principal L'objectif principal de cette étude pilote est d'étudier les effets des gallotannins (GT) de mangue, avec ou sans supplémentation du probiotique L. pentosus, sur la composition du microbiote intestinal et les marqueurs inflammatoires chez les individus obèses in vitro.

Objectifs spécifiques

1. Évaluer les changements dans la composition du microbiote intestinal chez les participants obèses suivant le traitement avec l'extrait de GT, avec ou sans supplémentation en L. pentosus.
2. Évaluer le potentiel anti-inflammatoire des GT et L. pentosus individuellement et en combinaison.
3. Identifier les effets synergiques potentiels entre les GT et L. pentosus en comparant la diversité microbienne, l'abondance des bactéries productrices d'AGCC et les changements des marqueurs inflammatoires à travers les groupes d'intervention.

Justification L'écologie microbienne intestinale perturbée et l'inflammation chronique de bas grade sont étroitement associées à l'obésité, et toutes deux ont un rôle dans le développement et la progression des troubles métaboliques. Pour gérer efficacement l'obésité, il est impératif de s'attaquer à ces anomalies métaboliques interconnectées. Les mangues sont une source riche de gallotannins (GT), qui ont démontré avoir des qualités anti-inflammatoires, de régulation métabolique et prébiotiques. Cependant, la capacité de l'hôte à les convertir en dérivés bioactifs - une capacité qui varie selon la composition du microbiote intestinal - est cruciale pour leurs avantages pour la santé.

La supplémentation probiotique Lactiplantibacillus pentosus présente une approche forte pour surmonter cette contrainte métabolique. En améliorant la fonction de barrière muqueuse, en régulant les réponses immunologiques et peut-être en aidant au métabolisme des polyphénols, L. pentosus a montré des promesses dans la promotion de la santé intestinale. Par conséquent, combiner ce probiotique avec de la mangue riche en GT peut augmenter l'exposition systémique aux métabolites GT avantageux. Comme observé dans les échantillons de plasma et de tissu adipeux, l'action combinée de la régulation microbienne et de la biodisponibilité améliorée des métabolites peut produire des effets thermogéniques et anti-inflammatoires plus notables, en particulier chez les personnes obèses.

Malgré les avantages attendus, il est important de reconnaître que tout changement dans l'inflammation ou le métabolisme observé après la prise de suppléments de L. pentosus pourrait ne pas être uniquement dû à des niveaux élevés de métabolites GT. Le probiotique lui-même peut avoir des effets biologiques propres, tels que modifier le système immunitaire de l'hôte ou concurrencer directement les bactéries qui causent l'inflammation. Par conséquent, le but de cette étude est d'explorer les interactions fonctionnelles entre la supplémentation probiotique et les aliments riches en GT dans un cadre pratique et intégratif plutôt que d'identifier des voies spécifiques aux GT.

Considérant l'intérêt croissant pour les thérapies ciblant le microbiome intestinal et la nutrition personnalisée, cette étude est à la fois nécessaire et opportune. Elle offrira des informations fondamentales sur les façons dont les interactions entre les polyphénols et les probiotiques affectent les marqueurs métaboliques et inflammatoires clés dans les groupes les plus à risque de maladie chronique. En fin de compte, les résultats pourraient influencer les recommandations diététiques et les plans de supplémentation conçus pour améliorer les résultats de santé chez les personnes obèses en utilisant des techniques conscientes du microbiome.

Méthodologie Conception de l'étude Cette étude est un essai clinique humain. La conception de l'étude est randomisée, en double aveugle, contrôlée par placebo. Les participants seront invités à fournir des échantillons humains tels que la salive, le sang et les selles. L'étude a été approuvée par les comités d'examen institutionnel (IRB) de Prairie View A&M University (PVAMU) et de Texas A&M University et sera enregistrée sur www.Clinicaltrials.gov.

Population de l'étude Un total de 20 volontaires sera recruté pour cette étude, avec 15 personnes vivant avec l'obésité faisant partie du groupe d'intervention, tandis que 5 individus minces et en bonne santé formeront partie du groupe témoin. Pour le groupe d'intervention, les 15 volontaires seront randomisés en 3 groupes, avec n=5 participants par groupe. Le recrutement se fera en partageant des flyers de recrutement dans des zones clés telles que les épiceries, supermarchés, églises, centres communautaires et autres centres d'événements dans le comté de Waller et autres comtés environnants. Les participants seront interrogés avec des questions de dépistage avant de les recruter dans l'étude.

Instruments Une gamme d'instruments sera utilisée pour assurer une collecte et une analyse précises des données. Les cellules buccales seront collectées avec des écouvillons buccaux ADN Isohelix SK-1, et les échantillons biologiques (plasma, urine et selles) seront stockés à -80 °C dans des conditions appropriées. Les biomarqueurs inflammatoires et métaboliques seront mesurés en utilisant un test multiplex à base de billes avec analyse sur le système Luminex L200 et le logiciel xPONENT. Le génotypage sera effectué avec des tests TaqMan pour détecter des variants SNP sélectionnés. Le profilage du microbiome sera réalisé par extraction d'ADN avec le kit QIAamp DNA Stool Mini Kit de Qiagen, séquençage sur plateformes Illumina (MiSeq ou NovaSeq) et analyse avec QIIME2, bases de données SILVA/Greengenes, LEfSe et PICRUSt2. L'analyse chimique des métabolites gallotannins sera effectuée en utilisant HPLC-ESI-MSn sur un triple quadripôle Thermo Finnigan Altis et un piège ionique haute résolution HPLC-MS. Enfin, les tests immunologiques ex vivo impliqueront la stimulation des cellules mononucléaires du sang périphérique avec LPS, et les niveaux de cytokines seront quantifiés avec le test Multiplex xMAP.

Collecte d'échantillons Les échantillons de plasma seront collectés au départ, semaine 1 après un jeûne nocturne. Des aliquotes de plasma seront préparées immédiatement après leur obtention et stockées à -80 °C jusqu'à analyse. Les selles seront collectées dès que disponibles et immédiatement traitées anaérobiquement. Les participants collecteront des échantillons de cellules buccales au départ en utilisant des écouvillons buccaux ADN Isohelix SK-1 et des capsules séchées Isohelix.

Analyse d'échantillons Marqueurs inflammatoires et métaboliques Les échantillons de plasma sanguin seront analysés pour évaluer les niveaux de divers biomarqueurs inflammatoires. Ceux-ci incluront des cytokines inflammatoires telles que l'interleukine-10 (IL-10), la protéine chimiotactique des monocytes-1 (MCP-1) ; et le marqueur cardiovasculaire protéine C-réactive (CRP). Toutes les mesures seront effectuées en utilisant un test multiplex à base de billes (Millipore, Billerica, MA).

Génotypage L'ADN et les loci génotypés spécifiques seront extraits en utilisant des tests de génotypage TaqMan pour fournir un score bi-allélique de polymorphismes mononucléotidiques pour les gènes suivants : gène associé à la masse grasse et à l'obésité [FTO (rs9939609)] et désaturase d'acides gras 1 [FADS1 (rs174546)].

Test de microbiome L'ADN microbien sera extrait des échantillons de selles en utilisant le kit QIAamp DNA Stool Mini Kit de Qiagen. Le séquençage du gène de l'ARNr 16S (région V3-V4) sera effectué en utilisant la plateforme Illumina MiSeq. Pour une analyse plus approfondie, le séquençage métagénomique shotgun sera considéré en utilisant la plateforme Illumina NovaSeq. Les données de séquence seront traitées en utilisant Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME)2. La classification taxonomique utilisera les bases de données SILVA ou Greengenes.

Indices de diversité :

• La diversité alpha sera calculée en utilisant les indices de Shannon et Chao1.
• La diversité bêta sera évaluée en utilisant les distances de Bray-Curtis et UniFrac.

L'analyse d'abondance différentielle sera effectuée en utilisant LEfSe, et les fonctions microbiennes prédites seront inférées via Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt2) en utilisant R studio.

Analyse chimique Les métabolites GT seront isolés en centrifugant d'abord pour éliminer la biomasse puis extraits avec de l'acétate d'éthyle en utilisant du gallate d'éthyle comme standard interne. Les paramètres MS seront optimisés en utilisant des standards des métabolites prédits lorsqu'ils sont disponibles pour l'identification des fragments parent/fille avec la plus haute intensité. Les métabolites cibles seront quantifiés en utilisant le balayage complet, SRM (ion unique) et MRM (surveillance de réaction multiple) sur un HPLC-ESI-MSn utilisant un triple quadripôle Thermo Finnigan Altis en utilisant des standards internes. Les métabolites non ciblés ou à faible concentration seront identifiés/quantifiés dans le laboratoire de métabolomique de Texas A&M en utilisant un piège ionique haute résolution HPLC-MS

Analyse statistique Tous les tests statistiques seront effectués au niveau 0,05 et seront bilatéraux. Les données seront examinées pour la normalité, et toutes les variables non normales seront transformées en log10. L'analyse sera faite sur la base de l'intention de traiter (ITT). Technique ANOVA pour les designs croisés et, si nécessaire, complétée par le test de rang équivalent de Wilcoxon. Le changement absolu par rapport à la base de référence sera testé, et des analyses secondaires seront effectuées sur la base du pourcentage de changement par rapport à la base de référence. Le résultat principal est le changement des biomarqueurs d'inflammation dans le plasma, car ce résultat s'applique aux individus minces et obèses. Tous les autres résultats investigués seront traités comme des résultats secondaires. Une analyse secondaire supplémentaire des effets du traitement utilisera l'analyse de covariance basée sur les caractéristiques de base des patients. Nous assignerons au hasard la moitié des patients à chacune des deux séquences de traitement pour maintenir un design expérimental équilibré. La randomisation par blocs sera avec des nombres de blocs mixtes pour protéger la randomisation et l'équilibre dans l'assignation des traitements, éliminer les biais possibles et préserver l'aveuglement. Chaque bloc consistera en un individu.

Considérations éthiques L'approbation éthique a été demandée et approuvée par le comité d'examen institutionnel (IRB) de Texas A&M University et Prairie A&M University avant de procéder au recrutement et à la collecte de données. Ceci est important car cette étude implique des sujets humains et il est important de protéger leurs droits et de maintenir une confidentialité totale. Pour maintenir la confidentialité, un formulaire de consentement sera signé par les participants qui se qualifient pour participer à l'étude. Le formulaire de consentement contiendra un aperçu de l'étude, les informations sur les participants qui seront collectées et les échantillons biologiques à collecter.