Wpływ galotanin na mikrobiom jelitowy i ich oddziaływanie na markery zapalne u osób otyłych.

Wstęp Tło Otyłość jest poważną, powszechną i kosztowną chorobą przewlekłą, a według raportu Centrum Kontroli i Zapobiegania Chorobom (CDC), ponad 2 na 5 dorosłych w Stanach Zjednoczonych (USA) żyje z otyłością. Problem otyłości w USA ma tendencję wzrostową, ponieważ raporty wykazały, że częstość występowania otyłości wśród dorosłych Amerykanów w wieku 20 lat i starszych w latach 2017-2020 wynosiła 41,9%, wzrastając z 30,5% w 2000 roku. Jednocześnie częstość występowania ciężkiej otyłości również wzrosła z 4,7% do 9,2%. Oznacza to, że ponad 100 milionów dorosłych w USA żyje z otyłością, podczas gdy ponad 22 miliony osób żyje z ciężką otyłością.

Główną przyczyną otyłości jest nieprawidłowe i nadmierne gromadzenie się lipidów w wielu narządach i tkankach, szczególnie w obszarze trzewnym lub brzusznym, w tym w białej tkance tłuszczowej (WAT), co określa się jako otyłość brzuszną. Na wiele ważnych chorób niezakaźnych, takich jak cukrzyca, metabolicznie zależna stłuszczeniowa choroba wątroby (MAFLD), choroby układu krążenia, nadciśnienie i zaburzenia nerkowe, znaczący wpływ ma ten typ otyłości. Jednym z głównych mechanizmów patogenetycznych w otyłości uważa się upośledzoną adipogenezę, czyli proces różnicowania adipocytów.

Zwiększony stres oksydacyjny i stan zapalny to dalsze cechy niezdrowej przebudowy WAT. Struktury histologiczne w kształcie korony (CLS) tworzą się, gdy powiększone adipocyty uwalniają chemokiny, które przyciągają komórki odpornościowe, głównie makrofagi, do otoczenia adipocytów. Mechanizm ten nasila stan hiperzapalny, wyzwalając prozapalne czynniki regulacyjne, takie jak czynnik jądrowy kappa B (NF-κB), co z kolei zwiększa produkcję genów zapalnych i przeważa nad przeciwzapalnymi regulatorami, takimi jak interleukina 10 (IL-10). Ponadto, stres oksydacyjny indukowany przez reaktywne formy tlenu (ROS) może przezwyciężyć regulację antyoksydacyjną, zwłaszcza ekspresję genów antyoksydacyjnych zależną od czynnika jądrowego erytroidalnego 2 związanego z czynnikiem 2 (NFE2L2/NRF2).

Problemy metaboliczne, takie jak oporność na insulinę, dyslipidemia i zaburzona adipogeneza, są spowodowane zarówno stresem oksydacyjnym, jak i stanem zapalnym. Dlatego metody mające na celu uniknięcie hipertrofii adipocytów, poprawę adipogenezy w celu tworzenia normalnych adipocytów, odwrócenie szkodliwej przebudowy WAT oraz ograniczenie stresu oksydacyjnego i stanu zapalnego mogą być skutecznymi sposobami zwalczania otyłości i zespołu metabolicznego.

Stosowanie interwencji dietetycznych w zapobieganiu i leczeniu otyłości jest stosowane od wielu lat i zostało opisane przez badaczy jako podstawowe. Spożywanie posiłków lub produktów naturalnych, w tym owoców i warzyw, które mają niską gęstość energetyczną i wysoką zawartość substancji bioaktywnych, zostało zaproponowane jako sposób na zarządzanie otyłością i związanymi z nią problemami. Wiadomo, że jadalne dzikie owoce i warzywa z różnych regionów zawierają różnorodne substancje bioaktywne, w tym fenole, które mogą mieć działanie przeciwzapalne, antyoksydacyjne i regulujące metabolizm. Ekstrakty owoców zawierające flawonoidy i polifenole, takie jak kwercetyna, katechina i rutyna, wykazały pozytywne korzyści w zakresie markerów dysfunkcji metabolicznej. W modelach zwierzęcych otyłości obejmują one zmniejszenie adipocytów i makrofagów, gromadzenia się lipidów, trzewnej tkanki tłuszczowej oraz markerów stanu zapalnego i stresu oksydacyjnego.

Wysokie stężenie substancji fenolowych (takich jak kwas galusowy, galotanina, glikozydy galoilowe i flawonoidy) w mango (Mangifera indica L.) sugeruje, że mają one silny potencjał antyoksydacyjny i przeciwzapalny, co wskazuje, że polifenole pochodzące z mango mogą pomóc w zapobieganiu chorobom przewlekłym związanym z otyłością. W badaniach przedklinicznych spożycie mango zmniejszyło otyłość i poprawiło profile lipidowe, tolerancję glukozy oraz ekspresję cytokin zapalnych u szczurów karmionych dietą wysokotłuszczową. Prawdopodobnie hamowanie adipogenezy przez ekstrakty mango jest związane z redukcją wzrostu klonalnego mitotycznego, kluczowego etapu w rozpoczęciu różnicowania adipocytów, zgodnie z modelem in vitro wykorzystującym komórki preadipocytów 3T3-L1.

Badania kliniczne na ludziach również wykazały, że suplementacja mango obniża poziom glukozy we krwi u osób otyłych, osób z cukrzycą typu 2 oraz poprawia profile lipidowe i zdolność antyoksydacyjną u zdrowych dorosłych. U osób z nadwagą i hiperglikemią wykazano, że naturalne fitochemikalia z owoców mango i ich metabolity, takie jak mangiferyna, podnoszą poziom HDL i obniżają poziom trójglicerydów i wolnych kwasów tłuszczowych. Zgodnie z tymi wynikami, polifenole ekstrahowane z mango mają silne właściwości przeciwzapalne i antylipogenne, które mogą pomóc w zapobieganiu przewlekłym zaburzeniom związanym z otyłością.

Stwierdzenie problemu Na całym świecie otyłość stała się epidemią skomplikowanych, wieloczynnikowych problemów metabolicznych, które powodują wzrost częstości występowania chorób przewlekłych, takich jak cukrzyca typu 2, choroby serca i niektóre rodzaje nowotworów. Zmieniona ekologia mikrobiomu jelitowego, czyli dysbioza, oraz przewlekły stan zapalny o niskim nasileniu są kluczowymi składnikami patofizjologii otyłości. Zmniejszone populacje korzystnych bakterii produkujących krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA), wzrost taksonów prozapalnych i spadek różnorodności mikrobiologicznej są powszechnymi cechami tego stanu dysbiotycznego, które mogą przyczyniać się do utrzymania dysfunkcji metabolicznej i stanu zapalnego ogólnoustrojowego. Aby zmniejszyć stan zapalny i przywrócić równowagę mikrobiologiczną u osób otyłych, rośnie zainteresowanie tworzeniem interwencji dietetycznych.

Polifenole są dobrze znane ze swoich właściwości przeciwzapalnych, antyoksydacyjnych i prebiotycznych, zwłaszcza galotaniny (GT), które występują w mango. Po rozłożeniu przez mikroorganizmy jelitowe, GT mogą promować wzrost dobrych bakterii i hamować wzrost złych, jednak dokładne efekty mogą zależeć od składu mikroflory każdej osoby. Podobnie, Lactiplantibacillus pentosus poprawia integralność błony śluzowej jelit i moduluje funkcje immunologiczne, chociaż jego efekty w izolacji są często niespójne.

Lactiplantibacillus pentosus LPG1 (dalej określany jako LPG1) to ferment pochodzący z biofilmów oliwek stołowych, który wykazał właściwości probiotyczne w badaniach in vitro i in vivo (model mysi). Ten szczep posiada właściwości przeciwzapalne i fitazowe, może obniżać poziom cholesterolu, hamuje infekcje przenoszone drogą pokarmową, przyczepia się do komórek Caco-2 i nie wykazuje aktywności hemolitycznej, między innymi cechami. Ponadto badania kliniczne wykazały jego bezpieczeństwo u ludzi. W tym kontekście, niedawne badanie wykazało, że genom L. pentosus LPG1 nie zawiera genów oporności na antybiotyki i wirulencji, podczas gdy zawiera liczne potencjalnie korzystne bakterie, bakteriocyny, egzopolisacharydy, geny klasterów produkcji folianów oraz enzymy trawienne zdolne do rozkładania złożonych węglowodanów, takich jak galaktoza, glikogen, skrobia, celuloza lub ksylan.

Zdolność probiotyczna szczepów Lactiplantibacillus była już badana w badaniach klinicznych na ludziach. Kotani badał zdolność L. pentosus b240, pierwotnie wyizolowanego z fermentowanych liści herbaty, do stymulowania wydzielania immunoglobuliny A w ślinie u osób starszych. Wang badał wpływ doustnego spożycia Lactiplantibacillus pentosus Lp-8 na skład mikroflory kałowej. de Vos badał efekty doustnego spożycia kilku szczepów L. pentosus na odpowiedź immunologiczną, podczas gdy Rudzki badał wpływ doustnego L. pentosus 299 na zdolności poznawcze u pacjentów z depresją. Ostatnio Ahn badał efekty szczepu L. pentosus wyizolowanego z kimchi, u dzieci z alergicznie wrażliwym atopowym zapaleniem skóry i wykazał poprawę objawów u uczestników.

Chociaż nie zostało to empirycznie zbadane u osób otyłych, możliwość synergistycznej regulacji metabolitów pochodzących z mikroorganizmów lub osłabienia wskaźników zapalnych jest szczególnie intrygująca. Niniejsze badanie pilotażowe ma na celu wypełnienie tej luki, oceniając efekty ekstraktu GT, z suplementacją L. pentosus lub bez, na mikroflorę jelitową i stan zapalny u dorosłych z otyłością in vitro. Wyniki będą wskazówką dla przyszłych podejść w spersonalizowanym żywieniu i leczeniu otyłości, rzucając światło na to, czy kombinacje polifenoli i probiotyków mogą zapewnić więcej korzyści zdrowotnych niż terapia pojedynczym środkiem.

Znaczenie badania Przewlekły stan zapalny o niskim nasileniu i zaburzona ekologia mikrobiomu jelitowego są obecnie rozumiane jako kluczowe czynniki w rozwoju i progresji otyłości oraz powiązanych chorób metabolicznych. Postęp w wysiłkach zapobiegawczych i terapeutycznych w otyłości zależy od skutecznego zarządzania tymi powiązanymi dysfunkcjami. Popularny owoc tropikalny, mango (Mangifera indica L.) jest szczególnie bogaty w galotaniny (GT), podklasę hydrolizowalnych polifenoli, które wykazały właściwości przeciwzapalne, antyoksydacyjne, regulujące metabolizm i prebiotyczne. Jednak biotransformacja GT w absorbowalne, prozdrowotne metabolity przez bakterie jelitowe jest głównym czynnikiem ich bioaktywności. Potencjalne korzyści polifenoli pochodzących z mango nie są konsekwentnie osiągane w różnych populacjach, ponieważ skład mikrobiologiczny różni się między osobami.

Suplementacja dobrze scharakteryzowanym probiotykiem Lactiplantibacillus pentosus przedstawia wykonalny sposób na rozwiązanie heterogeniczności w metabolizmie polifenoli. Ten probiotyk może pomóc w rozkładaniu złożonych związków fenolowych, takich jak GT, poprawić integralność bariery jelitowej i regulować odpowiedzi immunologiczne. L. pentosus może działać w tandemie z GT, aby zwiększyć biodostępność korzystnych metabolitów i mieć pozytywny wpływ na ekologię mikrobiomu jelitowego. To z kolei może nasilić efekty termogeniczne i przeciwzapalne, co może objawiać się lepszym zdrowiem jelit, niższymi poziomami biomarkerów zapalnych i poprawionymi profilami metabolicznymi, szczególnie u osób otyłych.

To odkrycie ma ważne implikacje dla kilku dziedzin. Nauka o żywieniu posuwa naprzód rozwijającą się dziedzinę żywności funkcjonalnej i nutraceutyków, oceniając połączone podejście polifenolowo-probiotyczne zaprojektowane do modyfikacji metabolizmu gospodarza poprzez mikroflorę jelitową. Dostarcza informacji wspierających spersonalizowane terapie dietetyczne dla otyłości oparte na składzie mikrobiologicznym i indywidualnej odpowiedzi metabolicznej, co jest zgodne z zasadami precyzyjnego żywienia. Z perspektywy zdrowia publicznego, wyniki mogą pomóc w opracowaniu opartych na żywności, skalowalnych metod zmniejszania ryzyka chorób przewlekłych w grupach podatnych. Otyłość pozostaje znaczącym czynnikiem ryzyka chorób układu krążenia, cukrzycy typu 2 i niektórych rodzajów nowotworów. Dlatego znalezienie naturalnie pochodzących, kulturowo akceptowanych i łatwo dostępnych interwencji dietetycznych, które poprawiają wyniki metaboliczne i zapalne, może być ekonomicznym sposobem zapobiegania i kontroli chorób, szczególnie w środowiskach upośledzonych.

Dla badań nad chorobami przewlekłymi, praca dostarcza mechanistycznych wglądów w rolę polifenoli dietetycznych i probiotyków w wpływaniu na stan zapalny ogólnoustrojowy i dysfunkcję metaboliczną. Może pomóc w kierowaniu przyszłymi badaniami klinicznymi mającymi na celu włączenie terapii ukierunkowanych na mikrobiom do standardowych modeli opieki w otyłości i innych chorobach niezakaźnych. Badanie ma również implikacje dla przemysłu owocowego i rolniczego, szczególnie w promowaniu właściwości funkcjonalnych mango i innych owoców bogatych w polifenole. Jeśli się powiedzie, to badanie zwiększy atrakcyjność rynkową mango jako żywności prozdrowotnej, zwiększy popyt i zachęci do rozwoju produktów spożywczych wzbogaconych w polifenole. Ponadto, wyniki mogą informować praktyki rolnicze mające na celu zwiększenie zawartości związków bioaktywnych w uprawach owoców.

Poza mango, to badanie stanowi podstawę do zbadania podobnych interakcji w innych owocach bogatych w polifenole, takich jak sumak, poszerzając relewantność badania do różnych kulturowych i geograficznych sytuacji dietetycznych. W dziedzinie badań mikrobiomu, to badanie posuwa naprzód nasze rozumienie, jak bioaktywne związki dietetyczne oddziałują z określonymi taksonami mikrobiologicznymi, aby wytwarzać funkcjonalne metabolity wpływające na zdrowie gospodarza. Pogłębia nasze zrozumienie różnorodności mikrobiologicznej, bakterii produkujących SCFA oraz szlaków mikrobiologicznych związanych ze stanem zapalnym u osób otyłych. Wreszcie, badanie przyczynia się do celów edukacyjnych i uczenia się, dostarczając praktyczny przykład translacyjnych badań żywieniowych. Łączy molekularne żywienie, mikrobiologię i nauki behawioralne, czyniąc je doskonałym studium przypadku do szkolenia studentów i praktyków w interdyscyplinarnych naukach o zdrowiu publicznym i biomedycznych. Promuje podejście systemowego myślenia wymagane do rozwiązywania złożonych problemów zdrowotnych za pomocą integracyjnych, opartych na żywności rozwiązań.

Pytania badawcze

Aby poprowadzić to dochodzenie, badanie koncentruje się na zrozumieniu, jak ekstrakt GT z mango i suplementacja Lactiplantibacillus pentosus wpływają na mikroflorę jelitową i stan zapalny u osób otyłych poprzez następujące pytania:

• Jak leczenie GT, z L. pentosus lub bez, wpływa na skład mikroflory jelitowej u dorosłych z otyłością?
• Jaki jest wpływ suplementacji GT i L. pentosus na biomarkery zapalne u osób otyłych?
• Czy zmienność genetyczna wśród osób z otyłością odpowiada za metabolizowanie galotanin.
• Czy kombinacja GT i L. pentosus wykazuje efekty synergistyczne w modulowaniu określonych taksonów mikrobiologicznych związanych z otyłością i stanem zapalnym w porównaniu z każdą interwencją osobno?

Hipoteza

1. Oczekuje się, że istnieje odwrotna korelacja między wskaźnikiem masy ciała (BMI) a stężeniem GT i metabolitów w osoczu, a także aktywnością termogeniczną i przeciwzapalną.
2. Oczekuje się, że L. pentosus zwiększy korzystne efekty galotanin

Cel i cele Główny cel Głównym celem tego badania pilotażowego jest zbadanie efektów galotanin (GT) z mango, z suplementacją probiotyku L. pentosus lub bez, na skład mikroflory jelitowej i markery zapalne u osób otyłych in vitro.

Szczegółowe cele

1. Ocenić zmiany w składzie mikroflory jelitowej u uczestników z otyłością po leczeniu ekstraktem GT, z suplementacją L. pentosus lub bez.
2. Ocenić potencjał przeciwzapalny GT i L. pentosus indywidualnie i w kombinacji.
3. Zidentyfikować potencjalne efekty synergistyczne między GT i L. pentosus poprzez porównanie różnorodności mikrobiologicznej, obfitości bakterii produkujących SCFA oraz zmian markerów zapalnych między grupami interwencyjnymi.

Uzasadnienie Zaburzona ekologia mikrobiomu jelitowego i przewlekły stan zapalny o niskim nasileniu są ściśle związane z otyłością i oba odgrywają rolę w rozwoju i progresji zaburzeń metabolicznych. Aby skutecznie zarządzać otyłością, niezbędne jest rozwiązanie tych powiązanych nieprawidłowości metabolicznych. Mango jest bogatym źródłem galotanin (GT), które wykazały właściwości przeciwzapalne, regulujące metabolizm i prebiotyczne. Jednak zdolność gospodarza do przekształcania ich w bioaktywne pochodne – zdolność, która różni się w zależności od składu mikroflory jelitowej – jest kluczowa dla ich korzyści zdrowotnych.

Suplementacja probiotykiem Lactiplantibacillus pentosus przedstawia silne podejście do przezwyciężenia tego ograniczenia metabolicznego. Poprzez poprawę funkcji bariery śluzowej, regulację odpowiedzi immunologicznych i prawdopodobnie pomoc w metabolizmie polifenoli, L. pentosus wykazał obietnicę w promowaniu zdrowia jelit. Dlatego połączenie tego probiotyku z mango bogatym w GT może zwiększyć ogólnoustrojową ekspozycję na korzystne metabolity GT. Jak widać w próbkach osocza i tkanki tłuszczowej, połączone działanie regulacji mikrobiologicznej i zwiększonej biodostępności metabolitów może wytworzyć bardziej zauważalne efekty termogeniczne i przeciwzapalne, szczególnie u osób otyłych.

Pomimo oczekiwanych korzyści, ważne jest uznanie, że jakiekolwiek zmiany w stanie zapalnym lub metabolizmie obserwowane po suplementacji L. pentosus mogą nie wynikać wyłącznie z podwyższonych poziomów metabolitów GT. Sam probiotyk może mieć efekty biologiczne samodzielnie, takie jak modyfikacja układu odpornościowego gospodarza lub bezpośrednia konkurencja z bakteriami wywołującymi stan zapalny. Dlatego celem tego badania jest zbadanie funkcjonalnych interakcji między suplementacją probiotyczną a żywnością bogatą w GT w praktycznym, integracyjnym ustawieniu, a nie identyfikacja specyficznych szlaków GT.

Biorąc pod uwagę rosnące zainteresowanie terapiami ukierunkowanymi na mikrobiom jelitowy i spersonalizowanym żywieniem, to badanie jest zarówno konieczne, jak i aktualne. Dostarczy fundamentalnych informacji o sposobach, w jakie interakcje między polifenolami i probiotykami wpływają na kluczowe markery metaboliczne i zapalne w grupach najbardziej narażonych na choroby przewlekłe. Ostatecznie, wyniki mogą wpłynąć na zalecenia dietetyczne i plany suplementacyjne zaprojektowane, aby poprawić wyniki zdrowotne u osób otyłych przy użyciu technik uwzględniających mikrobiom.

Metodologia Projekt badania To badanie jest klinicznym badaniem na ludziach. Projekt badania jest randomizowany, podwójnie zaślepiony, kontrolowany placebo. Uczestnicy zostaną poproszeni o dostarczenie próbek ludzkich, takich jak ślina, krew i kał. Badanie zostało zatwierdzone przez komisje etyczne (IRB) Prairie View A&M University (PVAMU) i Texas A&M University i zostanie zarejestrowane na www.Clinicaltrials.gov.

Populacja badania Łącznie 20 ochotników zostanie zrekrutowanych do tego badania, z 15 osobami żyjącymi z otyłością jako część grupy interwencyjnej, podczas gdy 5 szczupłych i zdrowych osób będzie stanowić część grupy kontrolnej. Dla grupy interwencyjnej, 15 ochotników zostanie randomizowanych do 3 grup, z n=5 uczestników na grupę. Rekrutacja będzie prowadzona poprzez udostępnianie ulotek rekrutacyjnych w kluczowych miejscach, takich jak sklepy spożywcze, supermarkety, kościoły, centra społeczne i inne centra wydarzeń w hrabstwie Waller i innych okolicznych hrabstwach. Uczestnicy zostaną poproszeni o odpowiedzi na pytania przesiewowe przed rekrutacją do badania.

Instrumenty Zakres instrumentów zostanie użyty, aby zapewnić dokładne zbieranie i analizę danych. Komórki policzkowe będą zbierane za pomocą wymazów bukkalnych DNA Isohelix SK-1, a próbki biologiczne (osocze, mocz i kał) będą przechowywane w -80°C w odpowiednich warunkach. Biomarkery zapalne i metaboliczne będą mierzone za pomocą testu multiplex opartego na kulkach z analizą na systemie Luminex L200 i oprogramowaniu xPONENT. Genotypowanie będzie przeprowadzane za pomocą testów TaqMan do wykrywania wybranych wariantów SNP. Profilowanie mikrobiomu będzie wykonane przez ekstrakcję DNA z zestawem Qiagen QIAamp DNA Stool Mini Kit, sekwencjonowanie na platformach Illumina (MiSeq lub NovaSeq) i analizę z QIIME2, bazami danych SILVA/Greengenes, LEfSe i PICRUSt2. Analiza chemiczna metabolitów galotaniny będzie przeprowadzona za pomocą HPLC-ESI-MSn na potrójnym kwadrupolu Thermo Finnigan Altis i pułapce jonowej wysokiej rozdzielczości HPLC-MS. Wreszcie, testy immunologiczne ex vivo będą obejmować stymulację jednojądrzastych komórek krwi obwodowej LPS, a poziomy cytokin będą kwantyfikowane za pomocą testu multiplex xMAP.

Zbiór próbek Próbki osocza będą zbierane na początku, tydzień 1 po nocnym poście. Aliquoty osocza będą przygotowywane natychmiast po uzyskaniu i przechowywane w -80°C do analizy. Kał będzie zbierany w miarę dostępności i natychmiast traktowany beztlenowo. Uczestnicy będą zbierać próbki komórek policzkowych na początku za pomocą wymazów bukkalnych DNA Isohelix SK-1 i kapsułek suszonych Isohelix.

Analiza próbek Markery zapalne i metaboliczne Próbki osocza krwi będą analizowane, aby ocenić poziomy różnych biomarkerów zapalnych. Będą one obejmować cytokiny zapalne, takie jak interleukina-10 (IL-10), białko chemotaktyczne monocytów-1 (MCP-1); oraz marker sercowo-naczyniowy białko C-reaktywne (CRP). Wszystkie pomiary będą wykonane za pomocą testu multiplex opartego na kulkach (Millipore, Billerica, MA).

Genotypowanie DNA i zgenotypowane specyficzne loci będą ekstrahowane za pomocą testów genotypowania TaqMan, aby dostarczyć dwu-allelicznego oceniania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu dla następujących genów: związany z masą tłuszczową i otyłością [FTO (rs9939609)] i desaturaza kwasów tłuszczowych 1 [FADS1 (rs174546)].

Test mikrobiomu DNA mikrobiologiczne będzie ekstrahowane z próbek kału za pomocą zestawu Qiagen QIAamp DNA Stool Mini Kit. Sekwencjonowanie genu 16S rRNA (region V3-V4) będzie przeprowadzone za pomocą platformy Illumina MiSeq. Dla głębszej analizy, sekwencjonowanie metagenomiczne typu shotgun będzie rozważane za pomocą platformy Illumina NovaSeq. Dane sekwencyjne będą przetwarzane za pomocą Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME)2. Klasyfikacja taksonomiczna będzie wykorzystywać bazy danych SILVA lub Greengenes.

Wskaźniki różnorodności:

• Różnorodność alfa będzie obliczana za pomocą wskaźników Shannon i Chao1.
• Różnorodność beta będzie oceniana za pomocą odległości Bray-Curtis i UniFrac.

Analiza różnicowej obfitości będzie wykonana za pomocą LEfSe, a przewidywane funkcje mikrobiologiczne będą wnioskowane przez Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt2) przy użyciu R studio.

Analiza chemiczna Metabolity GT będą izolowane przez najpierw odwirowanie, aby usunąć biomasę, a następnie ekstrakcję octanem etylu z użyciem galusanu etylu jako standardu wewnętrznego. Parametry MS będą optymalizowane przy użyciu standardów przewidywanych metabolitów, gdy dostępne, do identyfikacji fragmentów rodzic/córka o najwyższej intensywności. Metabolity docelowe będą kwantyfikowane za pomocą pełnego skanu, SRM (pojedynczy jon) i MRM (monitorowanie wielu reakcji) na HPLC-ESI-MSn przy użyciu potrójnego kwadrupola Thermo Finnigan Altis z użyciem standardów wewnętrznych. Niekierowane metabolity lub metabolity o niskim stężeniu będą identyfikowane/kwantyfikowane w laboratorium metabolomicznym Texas A&M przy użyciu pułapki jonowej wysokiej rozdzielczości HPLC-MS

Analiza statystyczna Wszystkie testy statystyczne będą przeprowadzane na poziomie 0,05 i będą dwustronne. Dane będą badane pod kątem normalności, a wszystkie nienormalne zmienne będą przekształcane log10. Analiza będzie przeprowadzona na zasadzie zamiaru leczenia (ITT). Technika ANOVA dla projektów krzyżowych i, w razie potrzeby, uzupełniona równoważnym testem rang Wilcoxona. Bezwzględna zmiana od wartości wyjściowej będzie testowana, a analizy wtórne będą przeprowadzane na podstawie procentowej zmiany od wartości wyjściowej. Pierwszorzędowym wynikiem jest zmiana biomarkerów zapalnych w osoczu, ponieważ ten wynik dotyczy osób szczupłych i otyłych. Wszystkie inne badane wyniki będą traktowane jako wyniki wtórne. Dalsza wtórna analiza efektów leczenia będzie używać analizy kowariancji opartej na charakterystykach wyjściowych pacjenta. Przypiszemy połowę pacjentów losowo do każdej z dwóch sekwencji leczenia, aby utrzymać zrównoważony projekt eksperymentalny. Randomizacja blokowa będzie jako mieszane numery bloków, aby chronić randomizację i równowagę w przypisaniu leczenia, eliminować możliwe uprzedzenia i zachować ślepotę. Każdy blok będzie składał się z jednej osoby.

Zagadnienia etyczne Zatwierdzenie etyczne zostało poszukiwane i uzyskane od instytucjonalnej komisji rewizyjnej (IRB) Texas A&M University i Prairie A&M University przed przystąpieniem do rekrutacji i zbierania danych. Jest to ważne, ponieważ to badanie obejmuje podmioty ludzkie i ważne jest, aby chronić ich prawa oraz utrzymać całkowitą poufność. Aby utrzymać poufność, formularz zgody będzie podpisywany przez uczestników kwalifikujących się do udziału w badaniu. Formularz zgody będzie zawierał przegląd badania, informacje o uczestniku, które będą zbierane, oraz próbki biologiczne do zebrania.