Effekter av gallotaniner på tarmmikrobiotan och hur det påverkar inflammatoriska markörer bland individer med fetma.

Introduktion Bakgrund Fetma är en allvarlig, vanlig och dyr kronisk sjukdom, och enligt en rapport från Center for Disease Control and Prevention lever mer än 2 av 5 vuxna i USA med fetma. Problemet med fetma i USA är en ökande trend, eftersom rapporter har visat att förekomsten av fetma bland vuxna i USA i åldern 20 år och äldre från 2017 till 2020 var 41,9%, en ökning från 30,5% år 2000. Samtidigt ökade förekomsten av svår fetma från 4,7% till 9,2%. Det betyder att över 100 miljoner vuxna i USA lever med fetma, medan mer än 22 miljoner människor lever med svår fetma.

Huvudorsaken till fetma är onormala och överdrivna fettansamlingar i många organ och vävnader, särskilt i det viscerala eller bukområdet, inklusive vitt fettväv (WAT), vilket kallas bukfetma. Många viktiga icke-smittsamma sjukdomar, såsom diabetes mellitus, metabol dysfunktion-associerad fettleversjukdom (MAFLD), hjärt-kärlsjukdomar, högt blodtryck och njursjukdomar, påverkas avsevärt av denna typ av fetma. En av de viktigaste patogena mekanismerna vid fetma har föreslagits vara försämrad adipogenes, eller processen för adipocytdifferentiering.

Ökat oxidativt stress och inflammation är ytterligare egenskaper hos ohälsosam WAT-ommodellering. Histologiska kronliknande strukturer (CLSs) bildas när förstorade adipocyter frisätter kemokiner som lockar till sig immunceller, främst makrofager, för att omringa adipocyterna. Genom att utlösa proinflammatoriska regulatorer som nukleär faktor-kappa B (NF-κB), vilket i sin tur ökar produktionen av inflammatoriska gener och övervinner antiinflammatoriska regulatorer som interleukin 10 (IL10), intensifierar denna mekanism det hyperinflammatoriska tillståndet. Dessutom kan reaktiva syrearter (ROS)-inducerad oxidativ stress övertrumfa antioxidativ reglering, särskilt den nukleära faktorn erytroid 2-relaterad faktor 2 (NFE2L2/NRF2)-medierad expression av antioxidativa gener.

Metabola problem, såsom insulinresistens, dyslipidemi och störd adipogenes, orsakas av både oxidativ stress och inflammation. Därför kan metoder för att undvika adipocyt-hypertrofi, förbättra adipogenes för att skapa normala adipocyter, vända skadlig WAT-ommodellering och begränsa oxidativ stress och inflammation vara effektiva sätt att bekämpa fetma och metabolt syndrom.

Användningen av kostintervention för fetmaförebyggande och behandling har använts i många år och har beskrivits av forskare som grundläggande. Att konsumera måltider eller naturprodukter, inklusive frukter och grönsaker, som är låga i energidensitet och höga i bioaktiva kemikalier har föreslagits som ett sätt att hantera fetma och dess associerade problem. Ätbara vilda frukter och grönsaker från olika områden är kända för att innehålla en mängd olika bioaktiva ämnen, inklusive fenoler, som kan ha antiinflammatoriska, antioxidativa och metaboltreglerande effekter. Fruktextrakter som innehåller flavonoider och polyfenoler, såsom kvercetin, katekin och rutin, har visat positiva effekter på markörer för metabol dysfunktion. I djurmödell för fetma inkluderar de minskningar i adipocyter och makrofager, fettansamling, visceralt fettväv och markörer för inflammation och oxidativ stress.

Den höga koncentrationen av fenoliska ämnen (såsom gallsyra, gallotannin, galloyl-glykosider och flavonoider) i mango (Mangifera indica L.) tyder på att de har starkt antioxidativ och antiinflammatorisk potential, vilket indikerar att polyfenoler producerade från mango kan bidra till förebyggande av kroniska sjukdomar kopplade till fetma. Mangokonsumtion minskade fetma och förbättrade lipidprofiler, glukostolerans och inflammatoriska cytokinuttryck hos råttor som fick en fet diet i preklinisk forskning. Minskningen av mitotisk klonal tillväxt, ett avgörande steg i starten av adipocytdifferentiering, är troligen kopplad till hämningen av adipogenes av mangoutdrag, enligt en in vitro-modell som använder 3T3-L1 preadipocytceller.

Human kliniska undersökningar har också visat att mangotillskott sänker blodsocker hos personer med fetma, individer med typ 2-diabetes och friska vuxnas lipidprofiler och antioxidativ kapacitet. Hos överviktiga personer med hyperglykemi har naturliga fytokemikalier från mangofrukter och deras metaboliter, såsom mangiferin, visats höja HDL-nivåer och sänka triglycerid- och fritt fettsyrenivåer. Enligt dessa resultat har polyfenoler extraherade från mango starka antiinflammatoriska och anti-lipogena egenskaper som kan hjälpa till att förhindra kroniska störningar kopplade till fetma.

Problemformulering Globalt har fetma blivit en epidemi av komplicerade, multivariata metabola problem som orsakar en ökning i förekomsten av kroniska tillstånd som typ 2-diabetes, hjärtsjukdom och flera typer av cancer. En förändrad tarmmikrobekologi, eller dysbios, och ett ihållande låggradigt inflammatoriskt tillstånd är nyckelkomponenter i patofysiologin för fetma. Minskade populationer av fördelaktiga bakterier som producerar kortkedjiga fettsyror (SCFAs), en ökning av proinflammatoriska taxa och en minskning av mikrobiell mångfald är vanliga egenskaper hos detta dysbiotiska tillstånd, vilka alla kan bidra till upprätthållandet av metabol dysfunktion och systemisk inflammation. För att minska inflammation och återställa mikrobiell balans hos personer med fetma finns det ett ökande intresse för att skapa kostinterventioner.

Polyfenoler är välkända för sina antiinflammatoriska, antioxidativa och prebiotiska egenskaper, särskilt gallotanniner (GTs), som finns i mango. Efter att ha brutits ner av tarmmikroorganismer kan GTs främja tillväxten av goda bakterier och hämma tillväxten av dåliga, men de exakta effekterna kan bero på sammansättningen av varje individs mikrobiota. På samma sätt förbättrar Lactiplantibacillus pentosus tarmmukosintegritet och modulerar immunfunktion, även om dess effekter i isolering ofta är inkonsekventa.

Lactiplantibacillus pentosus LPG1 (härefter kallad LPG1) är ett ferment som härstammar från bordolivbiofilmer som har visat probiotiska egenskaper i in vitro- och in vivo (musmodell) undersökningar. Denna stam har antiinflammatoriska och fytasegenskaper, kan sänka kolesterolvärden, hämmar matburna infektioner, fäster vid Caco-2-celler och har ingen hemolytisk aktivitet, bland andra egenskaper. Dessutom har kliniska undersökningar visat dess säkerhet hos människor. I detta avseende upptäckte en ny studie att L. pentosus LPG1-genomet saknar antibiotikaresistens- och virulensgener medan det innehåller många möjliga fördelaktiga bakterier, baktericiner, exopolysackarider, folatproduktionsklustergener och matsmältningsenzymer som kan bryta ner komplexa kolhydrater som galaktos, glykogen, stärkelse, cellulosa eller xylan.

Lactiplantibacillus-stammars probiotiska kapacitet har redan studerats i human kliniska prövningar. Kotani undersökte förmågan hos L. pentosus b240, ursprungligen isolerad från fermenterade teblad, att stimulera salivimmunoglobulin A-utsöndring hos äldre. Wang undersökte inverkan av oral intag av Lactiplantibacillus pentosus Lp-8 på sammansättningen av fekalmikrobiota. de Vos studerade effekterna av oral intag av flera L. pentosus-stammar på immunologiskt svar, medan Rudzki undersökte effekten av oral L. pentosus 299 på kognitiva färdigheter hos deprimerade patienter. Nyligen undersökte Ahn effekterna av en L. pentosus-stam isolerad från kimchi, på barn med allergenkänslig atopisk dermatit och visade förbättrade symptom hos deltagarna.

Även om det inte har utforskats empiriskt hos personer med fetma, är möjligheten till synergistisk reglering av metaboliter från mikroorganismer eller dämpning av inflammatoriska indikatorer särskilt intressant. Genom att bedöma effekterna av GT-extrakt, med eller utan L. pentosus-tillskott, på tarmmikrobiota och inflammation hos vuxna med fetma in vitro, syftar denna pilotstudie att fylla detta gap. Resultaten kommer att vägleda framtida tillvägagångssätt inom personanpassad nutrition och fetmahantering genom att belysa om polyfenol-probiotika-kombinationer kan ge fler hälsofördelar än enskildagensbehandling.

Studiens betydelse Kronisk låggradig inflammation och störd tarmmikrobekologi är nu förstått att vara nyckelfaktorer i utvecklingen och progressionen av fetma och relaterade metabola sjukdomar. Framstegen inom fetmaförebyggande och behandlingsinsatser beror på effektiv hantering av dessa sammankopplade dysfunktioner. En populär tropisk frukt, mango (Mangifera indica L.), är särskilt rik på gallotanniner (GTs), en underklass av hydrolyserbara polyfenoler som har visats ha antiinflammatoriska, antioxidativa, metaboltreglerande och prebiotiska egenskaper. Emellertid är biotransformationen av GTs till absorberbara, hälsofrämjande metaboliter av tarmmikrober en viktig faktor i deras bioaktivitet. De potentiella fördelarna med polyfenoler från mango uppnås inte konsekvent över populationer eftersom mikrobiell sammansättning skiljer sig mellan individer.

Tillskott med den välkarakteriserade probiotikan Lactiplantibacillus pentosus presenterar ett genomförbart sätt att hantera heterogeniteten i polyfenolmetabolism. Denna probiotika kan hjälpa till att bryta ner komplexa fenoliska kemikalier som GTs, förbättra tarmbarriärintegritet och reglera immunologiska svar. L. pentosus kan samverka med GTs för att öka biotillgängligheten av fördelaktiga metaboliter och ha en positiv inverkan på tarmmikrobekologin. Detta skulle sedan kunna intensifiera termogena och antiinflammatoriska effekter, vilket skulle kunna visa sig som bättre tarmhälsa, lägre nivåer av inflammatoriska biomarkörer och förbättrade metabola profiler, särskilt hos personer med fetma.

Denna upptäckt har viktiga konsekvenser för ett antal områden. Genom att bedöma en kombinerad polyfenol-probiotika-metod utformad för att ändra värdmetabolism genom tarmmikrobiota, framskrider näringsvetenskap det växande området funktionella livsmedel och nutraceuticals. Den ger information för att stödja individualiserade kostbehandlingar för fetma baserat på mikrobiell sammansättning och individuellt metabolt svar, vilket överensstämmer med principerna för precisionsnutrition. Ur folkhälsoperspektiv kan resultaten hjälpa till att utveckla matbaserade, skalbar metoder för att minska risken för kroniska sjukdomar i utsatta grupper. Fetma förblir en betydande riskfaktor för hjärt-kärlsjukdom, typ 2-diabetes och vissa typer av cancer. Därför kan det vara ett ekonomiskt sätt att förebygga och kontrollera sjukdom, särskilt i underprivilegierade miljöer, att hitta naturligt härledda, kulturellt accepterade och lättillgängliga kostinterventioner som förbättrar metabol och inflammatoriska utfall.

För kronisk sjukdomsforskning ger arbetet mekanistiska insikter i rollen av kostpolyfenoler och probiotika för att påverka systemisk inflammation och metabol dysfunktion. Det skulle kunna hjälpa till att vägleda framtida kliniska prövningar som syftar till att införliva mikrobiom-inriktade behandlingar i standardvårdsmodeller för fetma och andra icke-smittsamma sjukdomar. Studien har också konsekvenser för frukt- och jordbruksindustrier, särskilt för att främja funktionella egenskaper hos mango och andra polyfenolrika frukter. Om framgångsrik kommer denna studie att öka mångos marknadsföring som ett hälsofrämjande livsmedel, driva efterfrågan och uppmuntra utvecklingen av polyfenolförbättrade livsmedelsprodukter. Dessutom kan resultaten informera jordbrukspraktiker som syftar till att öka innehållet av bioaktiva föreningar i fruktgrödor.

Bortom mango lägger denna studie grunden för att undersöka jämförbara interaktioner i andra polyfenolrika frukter, såsom sumak, vilket breddar studiens relevans för olika kulturella och geografiska kostförhållanden. Inom mikrobiomforskning framskrider denna studie vår förståelse för hur kostens bioaktiva föreningar interagerar med specifika mikrobiella taxa för att producera funktionella metaboliter som påverkar värdhälsa. Den främjar vår förståelse av mikrobiell mångfald, SCFA-producerande bakterier och inflammation-relaterade mikrobiella vägar hos personer med fetma. Slutligen bidrar studien till utbildnings- och lärandemål genom att ge ett praktiskt exempel på translationsforskning inom nutrition. Den kombinerar molekylär nutrition, mikrobiologi och beteendevetenskap, vilket gör den till ett utmärkt fallstudie för att träna studenter och praktiker i tvärvetenskaplig folkhälsa och biomedicinska vetenskaper. Den främjar det systemtänkande tillvägagångssätt som krävs för att lösa komplexa hälsoproblem med integrerade, matbaserade lösningar.

Forskningsfrågor

För att vägleda denna undersökning fokuserar studien på att förstå hur GT-extrakt från mango och Lactiplantibacillus pentosus-tillskott påverkar tarmmikrobiota och inflammation hos individer med fetma genom följande frågor:

• Hur påverkar behandling med GTs, med eller utan L. pentosus, tarmmikrobiell sammansättning hos vuxna med fetma?
• Vad är inverkan av GT och L. pentosus-tillskott på inflammatoriska biomarkörer hos individer med fetma?
• Förklaras metabolisering av gallotanniner av genetisk variation bland individer med fetma.
• Uppvisar kombinationen av GTs och L. pentosus synergistiska effekter i att modulera specifika mikrobiella taxa associerade med fetma och inflammation jämfört med någon intervention ensam?

Hypotes

1. Det förväntas att det finns en omvänd korrelation mellan kroppsmassaindex (BMI) och plasmakoncentration av GTs och metaboliter, samt termogena och antiinflammatoriska aktiviteter.
2. L. pentosus förväntas öka de fördelaktiga effekterna av gallotanniner

Syfte och Mål Huvudsyfte Det primära syftet med denna pilotstudie är att undersöka effekterna av gallotanniner (GTs) från mango, med eller utan tillskott av probiotikan L. pentosus, på tarmmikrobiotasammansättning och inflammatoriska markörer hos individer med fetma in vitro.

Specifika Mål

1. Att utvärdera förändringar i tarmmikrobiotasammansättning hos deltagare med fetma efter behandling med GT-extrakt, med eller utan L. pentosus-tillskott.
2. Att bedöma den antiinflammatoriska potentialen hos GTs och L. pentosus individuellt och i kombination.
3. Att identifiera potentiella synergistiska effekter mellan GTs och L. pentosus genom att jämföra mikrobiell mångfald, överflöd av SCFA-producerande bakterier och förändringar i inflammatoriska markörer över interventionsgrupper.

Motivering Störd tarmmikrobekologi och kronisk låggradig inflammation är nära förknippade med fetma, och båda har en roll i utvecklingen och progressionen av metabola störningar. För att effektivt hantera fetma är det nödvändigt att hantera dessa sammankopplade metabola abnormiteter. Mango är en rik källa till gallotanniner (GTs), som har visats ha antiinflammatoriska, metaboltreglerande och prebiotiska egenskaper. Emellertid är värdens förmåga att omvandla dem till bioaktiva derivat—en förmåga som varierar enligt sammansättningen av tarmmikrobiota—avgörande för deras hälsofördelar.

Lactiplantibacillus pentosus probiotikatillskott presenterar ett starkt tillvägagångssätt för att övervinna denna metabol begränsning. Genom att förbättra mukosbarriärfunktion, reglera immunologiska svar och kanske hjälpa till med polyfenolmetabolism har L. pentosus visat potential för att främja tarmhälsa. Därför kan kombinationen av denna probiotika med mango som är rik på GT öka systemisk exponering för fördelaktiga GT-metaboliter. Som sett i plasma- och fettvävsprover kan kombinationsverkan av mikrobiell reglering och förbättrad metabolitbiotillgänglighet producera mer märkbara termogena och antiinflammatoriska effekter, särskilt hos personer med fetma.

Trots de förväntade fördelarna är det viktigt att erkänna att eventuella förändringar i inflammation eller metabolism som observeras efter intag av L. pentosus-tillskott kanske inte enbart beror på förhöjda GT-metaboliter. Probiotikan i sig kan ha biologiska effekter på egen hand, såsom att modifiera värdens immunsystem eller direkt konkurrera med bakterier som orsakar inflammation. Därför är syftet med denna studie att undersöka de funktionella interaktionerna mellan probiotikatillskott och GT-rika måltider i en praktisk, integrerad miljö snarare än att identifiera GT-specifika vägar.

Med tanke på det växande intresset för tarmmikrobiom-inriktade terapier och personanpassad nutrition är denna studie både nödvändig och aktuell. Den kommer att erbjuda grundläggande information om de sätt på vilka interaktioner mellan polyfenoler och probiotika påverkar viktiga metabola och inflammatoriska markörer i de grupper som är mest utsatta för kronisk sjukdom. I slutändan kan resultaten påverka kostråd och supplementplaner utformade för att förbättra hälsoresultat hos personer med fetma med mikrobiom-medvetna tekniker.

Metodologi Studiedesign Denna studie är en human klinisk prövning. Studiedesignen är en randomiserad, dubbelblindad, placebokontrollerad. Deltagare kommer att ombes att tillhandahålla humana prover såsom saliv, blod och avföring. Studien har godkänts av Institutional Review Boards (IRB) vid Prairie View A&M University (PVAMU) och Texas A&M University och kommer att registreras på www.Clinicaltrials.gov.

Studiepopulation Totalt 20 volontärer kommer att rekryteras för denna studie, med 15 personer som lever med fetma som en del av interventionsgruppen, medan 5 magra och friska individer kommer att utgöra kontrollgruppen. För interventionsgruppen kommer de 15 volontärerna att randomiseras till 3 grupper, med n=5 deltagare per grupp. Rekrytering kommer att göras genom att dela rekryteringsflyers på nyckelområden såsom livsmedelsbutiker, stormarknader, kyrkor, samhällscentra och andra evenemangscentra i Waller County och andra omgivande countyn. Deltagare kommer att få screeningfrågor innan de rekryteras till studien.

Instrument Ett utbud av instrument kommer att användas för att säkerställa noggrann datainsamling och analys. Bukala celler kommer att samlas med Isohelix SK-1 DNA buccal swabs, och biologiska prover (plasma, urin och avföring) kommer att lagras vid -80ºC under lämpliga förhållanden. Inflammatoriska och metabola biomarkörer kommer att mätas med en multiplex bead-baserad analys med analys på Luminex L200-systemet och xPONENT-mjukvara. Genotypning kommer att utföras med TaqMan-assays för att detektera utvalda SNP-varianter. Mikrobiomprofilering kommer att utföras genom DNA-extraktion med Qiagen QIAamp DNA Stool Mini Kit, sekvensering på Illumina-plattformar (MiSeq eller NovaSeq) och analys med QIIME2, SILVA/Greengenes-databaser, LEfSe och PICRUSt2. Kemisk analys av gallotanninmetaboliter kommer att utföras med HPLC-ESI-MSn på en Thermo Finnigan Altis triple quadrupole och HPLC-MS högupplöst jonfälla. Slutligen kommer ex vivo immunanalyser att involvera stimulering av perifera blodmononukleära celler med LPS, och cytokinnivåer kommer att kvantifieras med xMAP Multiplex Assay.

Provinsamling Plasmaprover kommer att samlas vid baslinje, vecka 1 efter en nattfasta. Alikvoter av plasma kommer att förberedas omedelbart efter att de erhållits och lagras vid -80ºC tills analys. Avföring kommer att samlas när tillgängligt och omedelbart anaerobt behandlas. Deltagare kommer att samla bukala cellprover vid baslinje med Isohelix SK-1 DNA buccal swabs och Isohelix torkade kapslar.

Provanalys Inflammatoriska och metabola markörer Blodplasmaprover kommer att analyseras för att bedöma nivåer av olika inflammatoriska biomarkörer. Dessa kommer att inkludera inflammatoriska cytokiner såsom interleukin-10 (IL-10), monocyt-kemotaktiskt protein-1 (MCP-1); och den kardiovaskulära markören C-reaktivt protein (CRP). Alla mätningar kommer att utföras med en multiplex bead-baserad analys (Millipore, Billerica, MA).

Genotypning DNA och genotypade specifika loci kommer att extraheras med TaqMan genotypningsassays för att ge bi-allell poängsättning av enkelnukleotidpolymorfismer för följande gener: fettmassa och fetma-associerad [FTO (rs9939609)] och fettsyradesaturas 1 [FADS1 (rs174546)].

Mikrobiomanalys Mikrobiellt DNA kommer att extraheras från avföringsprover med Qiagen QIAamp DNA Stool Mini Kit. 16S rRNA-gen-sekvensering (V3-V4-region) kommer att utföras med Illumina MiSeq-plattformen. För djupare analys kommer shotgun-metagenomsekvensering att övervägas med Illumina NovaSeq-plattformen. Sekvensdata kommer att bearbetas med Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME)2. Taxonomisk klassificering kommer att använda SILVA- eller Greengenes-databaser.

Diversitetsindex:

• Alfa-diversitet kommer att beräknas med Shannon- och Chao1-index.
• Beta-diversitet kommer att bedömas med Bray-Curtis- och UniFrac-avstånd.

Differentiell överflödsanalys kommer att utföras med LEfSe, och förutsagda mikrobiella funktioner kommer att härledas via Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt2) med R studio.

Kemisk analys GT-metaboliter kommer att isoleras genom att först centrifugeras för att ta bort biomassa och sedan extraheras med etylacetat med etylgallat som intern standard. MS-parametrar kommer att optimeras med standarder av de förutsagda metaboliter när tillgängliga för identifiering av förälder/dotter-fragment med högsta intensitet. Målmetaboliter kommer att kvantifieras med full skanning, SRM (single ion) och MRM (multiple reaction monitoring) på en HPLC-ESI-MSn med en Thermo Finnigan Thermo Finnigan Altis triple quadrupole med interna standarder. Oidentifierade metaboliter eller lågkoncentrationsmetaboliter kommer att identifieras/kvantifieras i Texas A&M metabolomics core laboratory med HPLC-MS högupplöst jonfälla

Statistisk analys All statistisk testning kommer att utföras på 0,05-nivå och kommer att vara tvåsidig. Data kommer att undersökas för normalitet, och alla icke-normala variabler kommer att log10-transformeras. Analys kommer att göras på basis av intention to treat (ITT). ANOVA-teknik för korsningsdesigner och, vid behov, kompletteras med ekvivalent Wilcoxon rank test. Absolut förändring från baslinje kommer att testas, och sekundära analyser kommer att utföras baserat på procentuell förändring från baslinje. Det primära utfall är förändringen i inflammationsbiomarkörer i plasma, eftersom detta utfall gäller både magra och individer med fetma. Alla andra undersökta utfall kommer att behandlas som sekundära utfall. Ytterligare sekundär analys av behandlingseffekter kommer att använda Analysis of Covariance baserat på patientens baslinjekarakteristika. Vi kommer att tilldela hälften av patienterna slumpmässigt till var och en av de två behandlingssekvenserna för att upprätthålla en balanserad experimentdesign. Blockrandomisering kommer att vara som blandade blocknummer för att skydda randomisering och balans i behandlingstilldelning, eliminera möjliga bias och bevara blindning. Varje block kommer att bestå av en individ.

Etiska överväganden Etiskt godkännande har sökts och godkänts från institutional review board (IRB) vid Texas A&M University och Prairie A&M University innan rekrytering och datainsamling påbörjas. Detta är viktigt eftersom denna studie involverar mänskliga subjekt och det är viktigt att skydda deras rättigheter och också upprätthålla total konfidentialitet. För att upprätthålla konfidentialitet kommer ett samtyckesformulär att undertecknas av deltagare som kvalificerar sig att delta i studien. Samtyckesformuläret kommer att innehålla översikten av studien, deltagarinformation som kommer att samlas in och biologiska prover som kommer att samlas in.