조산아의 마이크로바이옴 구축 (PIMENTO)

이전에 수행된 연구에서는 신생아 장내 미생물 군집의 변화와 관련된 몇 가지 요인을 확인했습니다. 여기에는 재태 연령, 분만 방식, 항생제 노출 및 수유 선택이 포함됩니다. 매우 저체중으로 태어난 아기의 어머니는 일반적으로 아기를 위해 모유를 유축하도록 권장됩니다. 이는 패혈증 및 괴사성 소장결장염의 낮은 비율과 관련이 있습니다. 이러한 효과 중 일부는 어머니로부터 모유에 포함된 박테리아와 관련이 있을 수 있습니다. 신생아 장내 미생물군집의 변화와 그들이 먹이는 우유의 미생물군 사이의 상관관계는 제한적입니다. 더욱이 모유 미생물총에 대한 냉동 효과(즉, 표준 모유 보관 관행)는 잘 규명되지 않았습니다. 또한 모유(MOM)가 없는 경우 기증자 모유를 제공하는 것이 임상적으로 적절하며, 저온 살균의 추가 과정이 그 안에 존재하는 박테리아 균주에 영향을 미치고 신생아 장의 콜로니화 패턴이 변경될 수 있습니다.

이것은 차세대 시퀀싱 기술을 사용하여 초미숙아의 장내 미생물군의 확립과 진화를 평가할 전향적 관찰 연구입니다. 데이터는 생물정보학을 사용하여 분석되어 자궁 내 엄마에서 유아로의 수직적 전파, 미숙아 미생물군집의 확립 및 진화를 평가하고 신생아 집중 치료실(NICU) 관리 전략이 개입 후 미생물군집 구성 및 회복을 어떻게 변화시키는지 평가합니다. 이 작업은 초미숙아를 위한 개별화된 프로바이오틱스 개발의 기초를 제공하고 NICU를 위한 미생물 보호 관리 전략을 개발하는 데 도움이 될 수 있는 자세한 정보를 제공할 것입니다.

모집 및 동의 절차 임신 32주 이전에 출산 가능성이 있는 경우 임산부에게 접근합니다. 연구의 목적과 참가자에게 기대되는 사항을 자세히 설명하는 참가자 정보 전단지가 제공됩니다. 이 연구는 또한 연구원에 의해 설명될 것입니다. 질문에 대한 답변이 제공되고 숙고할 충분한 시간이 제공됩니다. 유아와 함께 참여하려면 자격이 있는 것으로 추정되는 참여자는 정보에 입각한 동의서(ICF)에 서명해야 합니다. 그들은 서명된 동의서 사본을 받게 됩니다. 연기된 동의가 허용되지만 수집된 모든 영아 샘플은 현장에 저장되며 동의를 얻기 전에 처리되지 않습니다. 동의가 거부되면 수집된 모든 샘플은 즉시 폐기됩니다.

포함/제외 기준은 스크리닝에서 영아 분만에 대한 정보에 입각한 동의까지의 모든 시점에서 평가됩니다. 제외 기준이 출생 후 충족되는 경우 참가자는 연구에서 제외될 수 있습니다. 포함/제외 기준은 섹션 4.1/4.2를 참조하십시오. 다태아는 별도로 등록됩니다. 샘플은 각 유아로부터 수집되지만 모계 샘플은 한 세트만 수집됩니다. 쌍둥이 중 한 명은 자연분만하고 다른 한 명은 제왕절개로 분만하는 경우 가능하면 산모에게서 피부와 질 면봉을 채취합니다.

인구 통계, 분만, 영양 보조, 수유, 항생제 및 동반 질환에 관한 정보가 참가자로부터 수집됩니다. 또한 신경 발달을 평가하기 위해 2세에 영유아 발달의 Bayley 척도를 실시할 것입니다.

샘플 수집

유아 샘플

태변 및 대변 샘플 대변 샘플링은 유아용 침대 옆에서 수행됩니다. 입원 임상 간호사가 수행하는 직장 ​​면봉 검사는 NICU에 입원할 때 일상적으로 수행됩니다. 이때 마이크로바이옴 분석을 위해 추가 면봉을 채취합니다. 신생아 입원 중 첫 번째 태변 샘플을 기저귀에서 채취하고 그 후 일상적인 관리 중에 가능하면 격주로 영아의 기저귀에서 대변 샘플을 채취합니다.

영아 소변 입원 기간 동안 신생아 간호사가 영아의 기저귀에 멸균 패드/면봉을 넣어 매주 소변을 수집한 다음 다음 정기 진료 시 제거합니다.

유아 혈액 혈액 샘플은 임상적으로 명시된 이유로 정맥 천자 시에만 수집됩니다. 정맥 천자 및 샘플 수집은 임상 팀에서 수행합니다. 유아의 추정 총 혈액량(eTBV)(80mls/kg)의 1% 이하가 연구 목적으로 한 시점에서 수집됩니다(eTBV=80mls/kg). 혈액 샘플 수집을 위한 시점은 생후 첫 주(즉, 수유 시작 전), 생후 2주에서 4주 사이(즉, 경장 영양 공급이 완전히 확립되면), 그리고 퇴원 전. 연구 샘플 수집만을 목적으로 하는 정맥 천자는 허용되지 않습니다.

산모 샘플

구강 면봉 구강 샘플은 멸균 면봉을 사용하여 산모로부터 출생 후 가능한 한 빨리 연구 간호사/조사자가 수집합니다.

질 면봉(질 분만) 질 면봉은 분만실에서 조산사나 산부인과 의사가 산모로부터 채취하거나 산후병동에서 산모가 직접 채취합니다.

피부 면봉(제왕절개 분만) 피부 면봉은 분만 후 연구 간호사/연구원이 산모에게서 얻습니다. 참가자의 병원 손목 밴드 아래 손목의 내부 측면에서 수집됩니다.

산모 대변 샘플 참가자에게는 대변 샘플을 수집하기 위한 키트와 지침이 제공됩니다. 샘플은 연구팀이 제공 및 수집하는 즉시 동결됩니다.

모유 MOM의 모유 샘플은 연구 전반에 걸쳐 어머니로부터 수집됩니다. 산모는 아기가 NICU에 있는 동안 2주마다 5-15ml의 모유 샘플(가능한 경우)을 제공해야 합니다.

샘플 분석

영아 대변 분석 이종적으로 발현된 metagenomic DNA의 고처리량 스크리닝은 기능을 살펴보는 수단으로 검사됩니다. 특정 탄수화물 공급원(즉, 모유). 모든 유아의 대변에서 DNA를 추출한 후 범용 16s RNA 프라이머를 사용하여 PCR 앰플리콘을 생성하고 PCR 산물을 정제 및 정량화합니다. 그런 다음 Illumina Miseq 시퀀싱은 개인당 16S rRNA 유전자 조각에서 수행됩니다. 이 기술에서 생성되는 방대한 양의 데이터로 인해 후속 생물 정보 및 통계 분석이 필수적입니다.

영아 소변 분석 비표적 LC-MS 분석은 하이브리드 선형 이온 트랩 푸리에 변환(LTQ FT) Orbitrap 질량 분석기로 수행됩니다. XCMS 온라인 포털(https://xcmsonline.scripps.edu/) 데이터 처리(정렬, 피크 선택, 제로 피크 재통합, 기능 그룹화 및 품질 관리 샘플 평가)에 사용됩니다. 화합물에 주석을 달기 위해 가장 풍부하고 통계적으로 가장 중요한 기능을 기반으로 선택 전략이 사용됩니다. 대사체 식별을 돕기 위해 Spearman 상관 분석을 사용하여 추가 클러스터링 분석을 수행합니다.

영아 혈액에 대한 분석 기능적 대사체학과 관련하여 혈액 샘플을 검사할 것입니다. 여기에는 산탄총 대사체학을 사용한 분석 및 알려진 미생물 신호 그룹과의 관계를 찾는 동시에 대변 미생물군집 고처리량 데이터 세트와의 비교가 포함됩니다.

산모 샘플 분석 일반적인 임상 및 인구통계학적 데이터와 함께 분만 전후 구강, 질 및 피부 미생물 조성을 분석할 것입니다. 이전 연구와 모체 미생물군 프로필을 비교하고 모체-영아 전파에서 미생물의 수직 및 수평 이동을 평가하기 위해 초기 영아 장내 미생물군 데이터로 데이터를 조사할 것입니다. 샘플에서 DNA를 추출한 다음 범용 16s RNA 프라이머를 사용하여 PCR 앰플리콘을 생성하고 PCR 산물을 정제 및 정량화합니다. 그런 다음 Illumina Miseq 시퀀싱은 개인당 16S rRNA 유전자 조각에서 수행됩니다. 이 기술에서 생성되는 방대한 양의 데이터로 인해 후속 생물 정보 및 통계 분석이 필수적입니다.

시퀀싱 및 정량적 PCR을 포함하지만 이에 국한되지 않는 최첨단 방법을 사용하여 연구자가 대변 미생물 구성을 미생물 함량에 대해 분석합니다.

조사관은 일반 임상 및 인구통계학적 데이터와 함께 모체 분변 미생물 구성 및 분변 미생물 메타게놈을 분석할 것입니다. 분변 미생물 구성 서열은 어떤 박테리아 유형이 존재하는지 밝히고 metagenomic 분석은 미생물 부하의 대사 가능성을 나타냅니다. 우리는 서로 다른 집단의 기능을 살펴보는 수단으로 이종적으로 발현된 metagenomic DNA의 고효율 스크리닝을 사용할 것을 제안합니다. 특정 탄수화물 공급원을 대사하는 전반적인 능력, 독소의 변형 등 유아 대변에 대해 설명된 대로 모체 대변에서 DNA를 추출합니다.

모유에 대한 분석 연구자들은 일반 임상 및 인구통계학적 데이터와 함께 우유 미생물 구성 및 미생물 메타게놈을 분석할 것입니다. 박테리아 프로필은 산모의 장내 미생물군집에 대해 보고된 이전 연구와 비교되고, 산모-유아 전파에서 미생물의 수평 이동을 평가하기 위해 데이터를 유아 대변 미생물군집 데이터와 연관시킵니다. heterologically 표현 metagenomic DNA의 높은 처리량 스크리닝은 기능성을 보는 수단으로 사용됩니다. 특정 탄수화물 공급원(예: 모유 올리고당). 모든 피험자의 모유에서 DNA를 추출한 후 범용 16s RNA 프라이머를 사용하여 PCR 앰플리콘을 생성하고 PCR 산물을 정제 및 정량화합니다. 그런 다음 Illumina Miseq 시퀀싱은 개인당 16S rRNA 유전자 조각에서 수행됩니다. 박테리오파지는 미생물 구성의 중요한 조절자이며 포식자와 먹이 사이의 적절한 우유 생태계 균형을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 박테리오파지는 서열 독립적 메타게노믹 시퀀싱을 위해 모유에서 분리됩니다. 면역글로불린과 관련된 박테리오파지는 유사하게 분리되고 배열될 것이다. 이 기술에서 생성되는 방대한 양의 데이터로 인해 후속 생물 정보 및 통계 분석이 필수적입니다. 생물정보 분석은 다른 생물학적 샘플에 대해 이전에 언급한 것과 동일합니다.

모든 분석 방법은 최첨단 방법론에 따라 적절하게 업데이트됩니다.

샘플 보관 모든 산모 샘플은 연구원이 즉시 수집하고 가능한 한 빨리 처리하고 보관을 위해 동결하기 위해 APC Microbiome Ireland의 외부 실험실로 운반할 수 있을 때까지 현장에서 -20°C로 동결합니다.

NICU에서 얻은 모든 영아 샘플은 가능한 빨리 처리하고 보관을 위해 동결하기 위해 APC Microbiome Ireland의 외부 실험실로 운반할 수 있을 때까지 연구용 냉동고에 보관됩니다.

생물정보학적 분석 생물정보학적 분석에는 다음이 포함됩니다. FLASH를 사용하여 300 bp 쌍방향 판독이 조립되고 QIIME 도구 모음이 쌍방향 판독의 추가 처리에 사용될 것입니다. 여기에는 품질 필터링 및 일치하지 않는 바코드 및 길이 미만의 시퀀스 제거가 포함됩니다. 임계값. OTU 서열은 PyNAST를 사용하여 정렬되고 SILVA SSURef 데이터베이스는 분류법을 결정하는 데 사용됩니다. 알파 및 베타 다양성은 QIIME를 사용하여 계산됩니다. 마지막으로 PCoA(Principal Coordinate Analysis) 플롯을 사용하여 UniFrac 거리 매트릭스를 기반으로 베타 다양성의 차이를 시각화합니다.

1차 종점 1차 연구 종점은 마지막으로 등록한 참가자의 24개월 평가입니다. 이 연구는 18개월 동안 임신 32주 이전에 태어난 80~100명의 영아를 등록하는 것을 목표로 합니다. 분석은 출생 후 첫 번째 샘플에서 수행되어 영아 내장의 기존 초기 식민지를 감지하고(수직 전송을 통해) 이러한 조산아에서 미생물군집 형성 패턴을 결정합니다.

규제 및 행정 절차 연구는 1964년 헬싱키 선언의 2013년 10월 브라질 포르탈레자 버전에 따라 수행됩니다. 프로토콜 및 참가자 정보 전단지/ICF는 Cork 교육 병원의 임상 연구 윤리 위원회의 승인을 받습니다.

참가자 정보/정보에 입각한 동의 이 연구에 사용된 정보에 입각한 동의서 양식과 연구 중에 변경된 내용은 사용 전에 Cork 교육 병원의 임상 연구 윤리 위원회에서 사전 승인을 받았습니다. 각 정보에 입각한 동의서에는 1988년 및 2003년의 임상시험관리기준(GCP) 및 데이터 보호법에 대한 ICH E6 가이드라인과 2018년 5월 25일부터 GDPR에서 현재 요구하는 모든 관련 요소가 포함됩니다.

참가자는 언제든지 불이익 없이 연구 참여를 철회할 수 있습니다. 또한 조사관은 참가자에게 최선의 이익이 되는 경우 연구에서 참가자를 철회할 수 있습니다. 참가자가 연구에서 탈퇴한 이유는 참가자 사례 노트에 문서화됩니다.

GCP 및 기록 보존 연구는 GCP(Good Clinical Practice)에 대한 최신 ICH(International Conference on Harmonization) 가이드라인에 따라 관리 및 수행됩니다. 연구자는 최고 수준의 의료 및 임상 연구 관행에 따라 여기에 설명된 모든 서비스 또는 여기에 설명된 서비스에 부수적인 모든 서비스의 수행을 수행하거나 직접 감독합니다. 이 연구 중에 수집된 데이터의 사용 및 저장은 일반 데이터 보호 규정(GDPR)(유럽 의회 및 이사회의 규정(EU) 2016/679) 및 데이터 보호법 2018(섹션 36(2) ) (건강 연구) 규정 2018.