비수술적 치주치료에 대한 타액 단백질체의 반응

연구 모집단 및 임상 검사

총 10명의 체계적으로 건강한 비흡연자 III기, C등급 치주염이 터키 Aydın에 있는 Aydın Adnan Menderes University 치주과에서 모집되었습니다.

전체 구강 치주 평가에는 프로빙 깊이, 임상 부착 손실, 프로빙 시 출혈이 있는 부위의 비율, 치은 지수, 치료 후 기준선(T0) 및 1개월(T1) 및 6개월(T6)에서의 플라크 지수 측정이 포함되었습니다. . 수동 치주 탐침(William's periodontal probe, Hu-Friedy, Chicago, IL)을 사용하여 제3대구치를 제외한 치아당 6개 부위에서 모든 측정값을 얻었다. 치조골 흡수는 각 참가자의 디지털 파노라마 방사선 사진에서 평가되었습니다. 모든 임상 측정은 숙련된 치주 전문의(B.A.)가 수행했습니다.

3기, C등급 치주염의 진단은 2017년 치주 및 임플란트 주위 질병 및 상태 분류에 관한 국제 워크샵에서 제안한 기준에 따라 수행되었습니다.

치료

기존의 사분면 스케일링 및 치근 활택술(SRP)은 타액 수집 및 치주 평가 후 오른쪽 상단 사분면에서 시작하여 시계 방향으로 매주 간격으로 4회 방문하여 기준선에서 수행되었습니다. SRP는 초음파 기구(Mini Piezon, EMS, Nyon, CH)와 수동 치주 큐렛(Gracey curets, scaler Hu-Friedy, Chicago, IL)을 사용하여 같은 치주과 의사(B.A.)에 의해 국소 마취하에 시행되었습니다. 현재의 모든 치아는 치근 표면이 시각적으로나 촉각적으로 깨끗하고 부드러워질 때까지 기구를 사용했습니다. 자가 수행한 플라크 제어 방법은 수정된 Bass 기법을 사용하여 중간 칫솔과 불소가 포함된 일반 치약을 하루 2회 사용하고 치실 및/또는 치간 칫솔을 사용하여 하루 1회 치간 청소를 하는 것으로 구성되었습니다. 후속 타액 샘플링 및 치주 평가는 SRP 완료 후 T1 및 T6에서 수행되었습니다.

타액 샘플링

T0, T1 및 T6에서 아침 8:00 - 10:00 사이에 참여자로부터 무자극 전 타액을 채취했습니다. 모든 환자는 샘플링 전 2시간 동안 식사, 음주 및 모든 구강 위생 절차를 삼가하도록 요청되었습니다. 환자는 먼저 수돗물로 입을 헹구고 샘플 희석을 피하기 위해 5분 동안 기다리도록 요청받았습니다. 자극받지 않은 타액은 5분 동안 수집되었습니다. 환자는 수동적 침흘림을 장려하기 위해 머리를 앞으로 기울이고 멸균 범용 폴리프로필렌 용기 튜브에 뱉어내도록 지시받았습니다. 샘플링 후 샘플을 즉시 냉장 보관소(4°C)로 옮기고 분주하고 필요할 때까지 -80°C에서 동결했습니다.

비표지 정량적 프로테오믹스 분석

T0, T1 및 T6(n = 30)에서 수집된 타액 상청액 샘플을 무표지 정량(LFQ) 단백질 접근법을 사용하여 분석했습니다.

샘플 준비

업데이트된 버전의 프로토콜과 함께 상업용 iST Kit(PreOmics, Germany)를 사용하여 샘플을 준비했습니다. Qubit® Protein Assay Kit(Life Technologies, Zurich, Switzerland)를 사용하여 단백질 농도를 추정했습니다. 각 시료에 대해 50µg의 단백질을 카트리지로 옮기고 50µL의 '다이제스트' 용액을 추가하여 분해했습니다. 37 °C에서 60분간 배양한 후 100 µL의 정지 용액으로 분해를 중단했습니다. 카트리지의 용액은 3800g에서 원심분리하여 제거한 반면, 펩티드는 iST-필터에 의해 유지되었습니다. 마지막으로, 펩티드를 세척, 용출, 건조하고 20 μL의 주사 완충액(3% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)에 재가용화했습니다.

액체 크로마토그래피-질량 분석

디지털 PicoView 소스(New Objective)가 장착되고 M-Class UPLC(Waters)에 연결된 Q Exactive HF-X 질량 분석기(Thermo Scientific)에서 질량 분석을 수행했습니다. 두 채널의 용매 구성은 채널 A의 경우 0.1% 포름산, 채널 B의 경우 0.1% 포름산, 99.9% 아세토니트릴이었습니다. 각 샘플에 대해 2μL의 펩티드를 상업용 MZ Symmetry C18 트랩 컬럼(100Å, 5μm , 180µm x 20mm, Waters) 다음에 nanoEase MZ C18 HSS T3 컬럼(100Å, 1.8µm, 75µm x 250mm, Waters). 펩티드는 85분에 8에서 27% B, 5분에 35% B 및 1분에 80% B의 구배에 의해 300 nL/min의 유속으로 용출되었습니다. 샘플은 무작위 순서로 수집되었습니다. 질량 분석기는 데이터 종속 모드(DDA)에서 작동되었으며 목표 값으로 누적된 후 200m/z에서 120'000의 분해능으로 전체 스캔 MS 스펙트럼(350 - 1'400m/z)을 획득했습니다. 3'000'000, 그 다음에는 주기당 20개의 가장 강렬한 신호에 대한 HCD(고에너지 충돌 해리) 조각화가 뒤따릅니다. HCD 스펙트럼은 28의 정규화된 충돌 에너지와 22ms의 최대 주입 시간을 사용하여 15'000의 해상도에서 획득되었습니다. 자동 이득 제어(AGC)는 100'000 이온으로 설정되었습니다. 충전 상태 스크리닝이 활성화되었습니다. 단일, 할당되지 않음 및 7보다 높은 청구 상태는 거부되었습니다. 강도가 250,000 이상인 전구체만 MS/MS용으로 선택되었습니다. MS/MS 측정을 위해 이전에 선택된 전구체 질량은 30초 동안 추가 선택에서 제외되었고 제외 창은 10ppm으로 설정되었습니다. m/z 371.1012 및 445.1200에서 내부 잠금 질량 보정을 사용하여 샘플을 획득했습니다.

단백질 식별 및 정량화

획득한 원시 MS 데이터는 MaxQuant(버전 1.6.2.3)에서 처리한 후 통합된 Andromeda 검색 엔진을 사용하여 단백질을 식별했습니다. 분석은 로컬 실험실 정보 관리 시스템(LIMS)에서 실행되었습니다. 스펙트럼은 Uniprot 인간 참조 프로테옴(분류법 9606, 20180703의 정식 버전) 및 인간 구강 미생물군 데이터베이스(http://www.homd.org/, 버전 주석이 달린 게놈 460+, 20180702), 역전된 디코이딩된 fasta 데이터베이스 및 일반적인 단백질 오염 물질에 연결됩니다. 시스테인의 카르바미도메틸화는 고정 변형으로 설정한 반면, 메티오닌 산화 및 N-말단 단백질 아세틸화는 변수로 설정했습니다. 효소 특이성은 트립신/P로 설정되어 7개 아미노산의 최소 펩티드 길이와 최대 2개의 누락된 절단을 허용합니다. MaxQuant Orbitrap 기본 검색 설정이 사용되었습니다. 최대 FDR(False Discovery Rate)은 펩타이드의 경우 0.01, 단백질의 경우 0.05로 설정되었습니다. LFQ가 활성화되었고 실행 간의 일치를 위한 2분 창이 적용되었습니다. MaxQuant 실험 설계 템플릿에서 각 파일은 개별 정량 값을 얻기 위해 실험 설계에서 별도로 유지됩니다.

단백질 강도 및 조절

R 패키지 prolfqua에 구현된 일련의 R 함수를 사용하여 미분 표현 분석을 수행했습니다. MaxQuant에 의해 보고된 펩타이드 강도는 샘플 평균과 분산이 동일하도록 log2 변환된 다음 z 변환되었습니다. 다음으로, 정규화된 단백질 강도는 Tukey's median polish를 사용하여 펩티드 강도로부터 추정되었습니다. 단백질 log2-배 변화는 표준화된 단백질 강도를 기반으로 계산되었습니다. 두 가지 요인(시간 및 환자)을 포함하는 선형 모델을 각 단백질에 적용하고 모델 매개변수를 기반으로 그룹 차이를 추정하고 테스트했습니다. 분산 추정치는 귀무 가설 유의성 검정의 통계적 검정력을 증가시키는 고처리량 실험의 병렬 구조를 이용하는 경험적 Bayes 접근 방식을 사용하여 조정되었습니다. 마지막으로 Benjamini 및 Hochberg 절차를 사용하여 p-값을 조정하여 FDR을 얻었습니다. 시점(T1 대 T0, T6 대 T0 및 T6 대 T1) 사이에서 차별적으로 조절되는 단백질은 FDR < 0.05로 간주되었습니다. R 함수 'prcomp'를 사용하여 시각화 목적으로 주성분 분석을 수행했습니다.

경로 분석

차별적으로 규제된 인간 단백질(FDR <0.05)은 QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis(IPA) 애플리케이션(QIAGEN Inc., https://digitalinsights.qiagen.com/IPA)에 추가로 적용되어 어떤 질병 및 생물학적 과정이 규제에 의해 영향을 받았는지 조사했습니다. 프로테옴 데이터 세트의 변경 사항. 이 분석은 규제 단백질과 관련 질병 또는 기능 사이의 예상되는 인과 효과를 기반으로 합니다. IPA는 저널 기사 및 데이터베이스의 과학 및 생물의학 정보를 결합한 QIAGEN의 지식 베이스를 기반으로 하는 강력한 생물정보 분석 도구로, 광범위한 오믹스 발현 데이터의 해석과 잠재적인 규제 네트워크 및 인과 관계의 예측을 허용합니다. 2022년 4월 12일에 T1 대 T0 및 T6 대 T0에 대한 log2-fold 변화 및 FDR 데이터를 기반으로 핵심 분석을 수행했으며, FDR에 의해 순위가 매겨진 상위 규제 질병 및 생물학적 프로세스가 식별되었습니다. 또한 z-score 예측 알고리즘을 적용하여 z-score가 ≥2 또는 ≤-2인 경우 질병 또는 기능 활동을 유의하게 증가(양성 z-점수) 또는 감소(음수 z-점수)로 분류하여 다음과 같이 제시했습니다. 사각형 크기(FDR)와 색상(z 점수)이 다른 히트맵. 더 큰 사각형은 데이터 세트의 규제 단백질과 특정 질병 또는 기능 사이에 더 중요한 중첩을 나타내며 사각형 색상은 질병 또는 기능의 변화 방향을 반영합니다(주황색: 증가, 파란색: 감소). 특정 질병 또는 기능과 관련된 단백질은 단백질 기능, 단백질 조절(상향 또는 하향 조절) 및 예상되는 연합/상호작용 유형(간접 또는 직접, 활성화 또는 억제)을 나타내는 네트워크 차트로 표시되었습니다.

통계 분석

R 패키지 prolfqua에 구현된 일련의 R 함수를 사용하여 미분 표현 분석을 수행했습니다. MaxQuant에 의해 보고된 펩타이드 강도는 샘플 평균과 분산이 동일하도록 log2 변환된 다음 z 변환되었습니다. 다음으로, 정규화된 단백질 강도는 Tukey's median polish를 사용하여 펩티드 강도로부터 추정되었습니다. 단백질 log2-배 변화는 표준화된 단백질 강도를 기반으로 계산되었습니다. 두 가지 요인(시간 및 환자)을 포함하는 선형 모델을 각 단백질에 적용하고 모델 매개변수를 기반으로 그룹 차이를 추정하고 테스트했습니다. 분산 추정치는 귀무 가설 유의성 검정의 통계적 검정력을 증가시키는 고처리량 실험의 병렬 구조를 이용하는 경험적 Bayes 접근 방식을 사용하여 조정되었습니다. 마지막으로 Benjamini 및 Hochberg 절차를 사용하여 p-값을 조정하여 FDR을 얻었습니다. 시점(T1 대 T0, T6 대 T0 및 T6 대 T1) 사이에서 차별적으로 조절되는 단백질은 FDR < 0.05로 간주되었습니다. R 함수 'prcomp'를 사용하여 시각화 목적으로 주성분 분석을 수행했습니다.