만성 폐질환 예방(CLD - 예방 연구)

배경 만성 폐질환(CLD)은 지속적인 폐 기능 장애, 천식 유사 증상 및 BPCO와 같은 장기적인 후유증이 있는 전신 상태를 나타내는 주산기 폐 손상의 가장 흔한 합병증 중 하나입니다. CLD는 산모의 흡연, 융모막염, 자궁 내 성장 제한(IUGR) 등 산전 위험 요인과 산소 결핍, 비경구 영양법, 염증, 기계적 환기 등의 산후 위험 요인을 인식합니다. 자궁 내 염증에 대한 노출은 신생아 면역 발달을 변화시키고 태아 폐가 침습적 기계적 환기 및 초생리적 산소에 대한 조절 장애가 지속되는 반응을 일으키기 쉽습니다. 생애 초기에 유해한(그리고 보호하는) 영향에 대한 반응은 유전적 및 후생적 메커니즘에 의해 조절되며, 이는 성인기에 심각한 결과를 가져오는 영구적인 구조적 변화를 초래할 수 있습니다. IUGR 임신은 증가된 산화 스트레스를 특징으로 하며 IUGR 영아는 성인기의 심혈관 질환, 대사 증후군, 폐 기능 장애 및 만성 신장 및 호흡기 질환의 위험이 높습니다. 폐 손상의 진행으로 이어지는 메커니즘에 대한 지식이 지속적으로 증가함에도 불구하고, 지금까지 CLD 예방으로 이어질 수 있는 효과적인 관리 방법은 개발되지 않았습니다.

목표

1. 생후 첫 12개월 동안 폐 기능의 심각한 경과를 예측할 수 있는 잠재적인 바이오마커를 전향적으로 식별하고 고위험 신생아를 조기에 식별할 수 있는 새로운 프로필을 실현합니다.
2. 심각한 폐 기능 장애 및 천식 발병과 상관관계가 있는 유전적 변이 인과 모델(MiSeq Illumina 플랫폼 사용)을 탐지합니다.
3. 처음 12개월 동안 폐 기능 장애의 중증도와 상관관계가 있는 항염증성 및 염증성 사이토카인 변이(MIP-1a, MCP-1, IL-8, TNF-a, IFN-g, IL-10)뿐만 아니라 MicroRNA도 검출합니다. 삶의 질과 천식 발병 위험.

실험 설계 이것은 다기관 종단 연구로, 그 주요 목표는 주산기부터 시작하여 만성 폐질환(CLD) 발병에 대한 새로운 고위험 신생아 프로필을 식별하는 것입니다. 이 목표를 달성하기 위해 모든 참가자 단위는 등록된 산모에게 질 면봉 채취를 수행하고 출생 시 태반 및 제대혈과 말초 혈액, 기관지 폐포 세척액(BALF), 태변 및 등록된 모든 신생아의 대변 샘플을 수집합니다. 연구는 산전 위험 요인의 평가로 시작됩니다.

분만 후 태반은 10% 완충 포르말린에 고정됩니다. 이후 거시적 및 현미경적 분석은 암스테르담 태반 워크숍 그룹 합의문에 따라 수행됩니다. 등록된 모든 여성의 질 면봉은 분만 시 수집됩니다. miRNA, 유전적 변이 및 사이토카인 분석을 위해 3ml의 제대혈(동맥 및/또는 정맥)을 수행합니다. 삽관된 영아의 경우 기관내관에 0.9% 염화나트륨 1ml/kg을 주입하고 멸균 점액 트랩으로 액체를 흡입하여 BALF 샘플을 채취합니다. 첫 번째 BALF 샘플은 생후 24시간 이내에 수집되는 반면, 추가 BALF 샘플은 아직 삽관된 신생아의 경우 생후 7일과 28일에 수집됩니다. 출생 후 첫 번째 태변 샘플과 추가 대변 샘플은 생후 7일, 28일, 6개월 및 12개월에 수집됩니다. 질 면봉, 태반, BALF, 태변 및 대변 샘플은 추가 처리가 완료될 때까지 -80°C에서 보관됩니다. 각 샘플에 대해 박테리아 DNA 추출은 제조업체 지침에 따라 DANAGENE MICROBIOME DNA 키트(Danagen-Bioted)를 사용하여 엄격하게 통제되는 레벨 2 생물학적 안전 작업장에서 수행됩니다.

출생 시(동맥) 및 생후 48시간의 제대 혈청에서 8-10개의 후보 miRNA, 특히 miR-451, miR-29b 및 miR-16이 다음을 억제하는 효과가 있는 것으로 나타났기 때문에 연구될 것입니다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 억제를 통한 혈관 신생 및 miR은 CLD에 대한 유전적 감수성과 관련이 있습니다. 유전자 분산 인과 모델은 차세대 시퀀싱 기술을 적용할 수 있는 MiSeq Illumina 플랫폼을 사용하여 생후 48시간(전혈 500μL 이상)에 등록된 모든 신생아에서 수행됩니다.

시간 경과에 따른 질병의 중증도와 상관관계가 있는 항염증성 및 염증성 사이토카인 변이를 검출하기 위해 입원 시(생후 48시간 이내) 포함된 유아로부터 제대혈 및 말초혈 샘플(EDTA 튜브에 2ml)을 채취합니다. , 생후 7일과 28일, 6개월과 12개월. 항-(INF-γ) 및 전염증성(IL-6 및 NGF) 사이토카인 수준을 모두 조사할 것입니다. 모든 샘플은 테스트할 때까지 -80°C에서 보관됩니다. 제조업체의 지침에 따라 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 사이토카인을 측정합니다.

연구자들은 또한 생후 첫 며칠 동안 신생아 분석을 통해 산모와 태반 데이터 사이의 연관성을 탐구하려고 노력할 것입니다. 신생아 집중 치료실에 신생아를 입원시키면 혈액 산소 공급의 정도와 변화, 산화 스트레스(OS) 및 OS 관련 질병의 원인이 되는 감염의 존재 여부를 확인하는 데 상당한 주의를 기울일 것입니다. 다음 검체를 수집합니다: 말초 혈액 1ml(생후 48시간 이내). 추가 말초 혈액 샘플은 생후 7일과 28일, 6개월과 12개월에 수집됩니다.

OS(산화 스트레스) 및 OS와 관련된 지질 매개체는 산화 단백질 손상(Advanced Oxidation Protein Products, AOPP) 및 지질 과산화(Isoprostanes, IsoPs)의 바이오마커에 의해 평가됩니다. 비효소 항산화 분자(비타민 E, 글루타티온, GSH 및 아스코르브산, AA)와 효소 항산화 분자(슈퍼옥사이드 디스뮤타제, SOD, 카탈라제, CAT 및 글루타티온 퍼옥시다제, GPx)를 측정하여 산화 스트레스 프로필에 대한 추가 평가가 수행됩니다. ). 이를 위해 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)와 가스 크로마토그래피 인터페이스 질량 분석법(GC-MS)이 사용됩니다. HPLC는 비타민 E, 글루타티온, GSH 및 AA를 검출합니다.

마지막 단계는 생후 첫 12개월 동안 심각한 폐 기능 장애가 있고 나중에 천식 및 COPD가 발생할 위험이 더 높은 고위험 신생아의 새로운 프로필을 전향적으로 식별하는 것입니다. 등록된 모든 아기의 장기 결과를 통해 자궁 내 노출소(융모막염 또는 태아 성장 제한)의 일부인 태반 분석, miRNA 발현, 염증 및 미생물군과 출생 후 염증을 수반하는 산화 스트레스 사이의 관계를 밝히기 위해 수행됩니다. 요인(침습적 호흡 지원, 동맥관 개존증, 폐렴, 패혈증) - 6개월 및 12개월에 비정상적인 폐 기능 측면에서 폐 결과.

생후 6개월과 12개월에 유아는 임상 및 폐 평가를 받게 됩니다. 폐 기능 검사(PFT)는 등록된 모든 영아에서 실시되며 일회 호흡 분석 및 질소 세척 검사가 포함됩니다. 폐용적, 흐름, 기능적 잔존 용량, 폐 청소 지수 5%(LCI 5), 폐 청소를 측정하는 미국 흉부 학회/유럽 호흡기 학회 권장 사항에 따라 조용하고 자연스러운 수면 중에 유아를 바로 누운 자세로 배치합니다. 지수 2.5%(LCI 2.5), 최고 일회 호기 유량/호기 시간 비율(tPTEF/tE)까지의 시간. 폐의 이상을 배제하기 위해 폐초음파를 시행하게 됩니다. 마스크에 적응한 후 일회 호흡, >2분 동안의 유량 루프 또는 >20 인공물 없는 호흡이 기록됩니다. 기능적 호흡 데이터를 생성된 생화학적 프로필의 데이터와 연관시키기 위해 PFT가 만들어집니다. 폐 기능, 출생 직전 생화학적 지표, 생후 6~12개월 유아의 생화학적 지표, 인체 측정 측정 간의 가능한 관계를 연구합니다. 자궁외 생활 중 폐 발달과 기능은 출생 전 측정과 관련이 있습니다. 재태 연령(AGA) 영아, 재태 연령에 비해 작은(SGA) 영아, 재태 연령에 비해 큰(LGA) 영아에 적합한 데이터가 비교됩니다.

데이터 수집 방법 영상, 조직 및 혈액 샘플에서 생성된 정량적, 정성적 데이터를 포함하여 여러 유형의 데이터가 수집됩니다. 목표 1, 2, 3에 대한 임상 데이터는 UO1- Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli-IRCCS(https://redcap-irccs.policlinicogemelli.it/)에서 호스팅되는 REDCap 전자 데이터 캡처 도구를 사용하여 수집 및 관리됩니다.

전용 전자 사례 보고서 양식(eCRF)이 개발될 예정입니다. 유사 익명화된 데이터는 관련 단위에서 수집됩니다. 조사자는 eCRF가 적절하고 완전하게 작성되었는지 확인할 책임이 있습니다. 임상 정보의 출처에는 의사의 환자 기록, 병원 기록, 실험실 기록 원본, 약국 기록, 초음파 검사 결과 등이 포함됩니다.

통계 계획 연구의 1차 종료점은 임상적, 인구통계학적, 실험실적 및 기타 매개변수가 PMA 36주차의 만성 폐질환 발병 및/또는 12개월령의 비정상적인 폐 기능의 발병을 예측할 수 있는지 여부를 확인하는 것입니다. ROC 곡선 아래 면적이 최소 0.75 ± 0.15인 허용 가능한 정확도 수준을 가정하면 42명의 환자의 표본 크기가 필요합니다.

통계 분석 샘플은 적절한 기술 통계 지수를 사용하여 임상 및 인구통계학적 특성을 설명합니다. 심층적으로, 정성적 데이터는 절대 및 상대 백분율 빈도로 표현되는 반면, 정량적 변수는 경우에 따라 평균 및 표준 편차(SD) 또는 중앙값 및 사분위간 범위(IQR)로 표시됩니다. 양적 변수의 가우스 분포를 확인하기 위해 Shapiro-Wilk 테스트가 적용됩니다. 기준선에서 그룹 간의 차이는 정성적 데이터와 관련하여 Chi-Squared 테스트 또는 Fisher-Freeman-Haltons 정확 테스트를 통해 적절하게 평가됩니다. 대신 정량적 데이터는 데이터 분포에 따라 독립 표본에 대한 스튜던트 t 검정 또는 Mann Withney의 비모수적 U 검정을 사용하여 비교됩니다. 바이올린 플롯은 유의미하거나 임상적으로 관련된 차이를 그래픽으로 표현하는 데 사용됩니다. 12개월 후 1차 결과의 차이에 대한 평가는 Kaplan-Meier 생존 분석을 통해 평가됩니다. 특히, 로그 순위 테스트(log-rank test)를 적용하여 적절한 누적 발생률 곡선을 그릴 것입니다. 12개월 후 1차 결과에 대한 잠재적 예측변수를 평가하기 위해 단일변수 및 다변수 Cox 회귀 모델이 적합해집니다. 심층적으로, 결과에 대한 잠재적 예측 변수는 일반 비례 위험 Cox 회귀 모델을 통해 평가되며 결과적으로 위험 비율(HR)과 95% 신뢰 구간(CI)이 보고됩니다. 위험 함수의 비례성은 위험 및 Schoenfeld 잔차 플롯을 육안으로 검사하여 평가됩니다. 비례성이 의심스러운 경우 Cox 가중치 회귀 모델이 적합해집니다. 다변수 모델에 포함될 예측 변수는 결과 변수별 최소 10개 이벤트 규칙과 일치하는 일변수 분석(p<0.05 또는 암시적, 즉 0.05 p <0.10) 및 전문가 의견 및 TRIPOD 권장 사항을 기반으로 선택됩니다. 모델의 성능은 Cindex, Somers Dxy-rank 상관 관계, Nagelkerke의 R2 값, 교정 절편 및 경사와 같은 여러 지표로 평가됩니다. C-지수는 AUC, 즉 모델의 정확도를 측정하는 것으로 해석될 수 있습니다. 통계적 유의성은 p<0.05 값에 대해 설정됩니다. 암시적인 p 값(0.05, p < 0.10)도 보고됩니다. 통계 분석은 STATA(StataCorp, USA) 및 R(https://www.r-project.org/)을 사용하여 수행됩니다.