생식세포종양에서의 액체생검

연구 설계 이는 TGCT 환자에서 ctDNA의 진단 및 예후적 가치를 평가하기 위한 전향적, 비치료적 임상시험입니다. 오스트리아의 치료 센터, SAG 레지스트리의 센터 및 독일의 선정된 센터에 내원하는 전이성 TGCT 환자 100명이 참여를 요청받으며, 질병 경과 중 정의된 시점에서 ctDNA 및 miR-371a-3p 분석을 위해 혈액이 채취됩니다. 또한 오스트리아 내 1기 질환 환자 100명이 포함됩니다.

수술 전 및 수술 중 샘플링: 수술 전에도 혈장 및 마이크로 RNA 샘플이 채취됩니다. 혈장은 또한 수술 중 정맥에서 채취됩니다.

고환 절제술 후 (화학요법 1주기 시작 전): 화학요법 시작 전 ctDNA 분석을 위해 두 개의 PAXgene® Blood ccfDNA 튜브(약 20ml)에 혈액이 채취됩니다. PAXgene 튜브와 종양 조직은 그라츠 의과대학 생물은행으로 보내져 보관됩니다. miR-371a-3p 채취를 위해 10ml 혈액이 혈청 튜브에 채취되고, 원심분리 후 2ml 혈청이 -80°C에 보관됩니다.

화학요법 2주기 시작 전: ctDNA 수치로 치료 반응을 평가하기 위해, 두 번째 화학요법 주기 투여 전 두 개의 PAXgene® Blood ccfDNA 튜브(약 20ml)가 채취됩니다. miR-371a-3p 채취를 위해 10ml 혈액이 채취되고, 위와 같이 처리됩니다.

치료 완료 후: 환자가 1차 치료를 완료하면 ctDNA 분석을 위해 또 다른 두 개의 PAXgene® Blood ccfDNA 튜브(약 20ml)가 채취됩니다. miR-371a-3p 채취를 위해 10ml 혈액이 채취되고, 위와 같이 처리됩니다.

재발 시: 전이성 TGCT 환자의 약 20-30%가 재발합니다. 이는 주로 반응이 없는 환자 또는 화학요법 완료 후 재발하는 환자일 수 있으며, 일반적으로 2년 이내에 발생합니다. 재발 시(영상 검사에서 확인되거나 고전적 종양 표지자 상승) ctDNA 분석을 위해 두 개의 PAXgene® Blood ccfDNA 튜브(약 20ml)가 채취됩니다. miR-371a-3p 채취를 위해 10ml 혈액이 채취됩니다.

샘플 분석 종양 샘플에서 추출된 원발성 종양 조직 DNA의 포괄적 분자 프로파일링은 GeneRead DNA FFPE Kit(QIAGEN)를 사용하여 수행됩니다. DNA는 Qubit(Thermo Fisher)를 사용하여 정량화됩니다. 조직을 포괄적으로 프로파일링하기 위해 duet multiomics solution evoC 플랫폼이 사용되며, 이는 유전자 변이에 대한 게놈 분석뿐만 아니라 메틸시토신(mC)과 하이드록시메틸시토신(hmC)을 구분하는 후성유전학적 분석을 가능하게 합니다. 이러한 결합된 게놈 및 메틸롬 분석은 열린 염색질 영역과 유전자 발현 내에서 두 가지를 구별함으로써 5mC와 5hmC 간의 상관관계를 밝힐 수 있습니다. 동일한 데이터 세트는 게놈 전체 복사 수 변이를 추론하는 데 사용될 수 있습니다. SCNA 및 초점 변이는 확립된 내부 알고리즘을 사용하여 호출됩니다. 종양 순도/배수성은 ichorCNA 알고리즘을 사용하여 평가되며, 이는 확률적 모델링을 위한 은닉 마르코프 모델(HMM)로, 시퀀싱 커버리지를 0.1X까지 낮추어 작동하며 3%의 종양 비율까지 SCNA를 감지할 수 있습니다. 종양 조직의 클로널성이 너무 낮은 경우, 심층 변이 프로파일링을 위해 선택적으로 엑솜 시퀀싱이 수행됩니다. 조직의 이중 모드 데이터는 진행 시점의 혈장 샘플 및 화학요법에 민감한 종양과 비교되어 획득성 및 원발성 저항성에 기여하는 요인을 식별합니다. 수술 중 채취된 조직은 그라츠 의과대학 병리학과로 보내져 DNA 추출 및 게놈 시퀀싱이 수행됩니다.

ctDNA 분석 혈액은 PAXgene® Blood ccfDNA 튜브에 채취되어 인간유전학연구소로 보내져 추가 처리됩니다. 혈장에서 cfDNA 추출은 QIAsymphony PAXgene Blood ccfDNA Kit(QIAGEN)를 사용하여 수행됩니다. SCNA를 식별하기 위해 sWGS(plasma-Seq)를 사용하고, 데이터를 다시 ichorCNA 알고리즘으로 분석합니다. 또는 민감도를 높이기 위해 12p 획득을 스크리닝하기 위해 dPCR이 수행됩니다. 질환 재발 환자의 고종양 비율 혈장 샘플은 추가로 Biomodal 플랫폼 및 전체 엑솜 시퀀싱을 사용하여 분석됩니다. 유전적 및 후성유전학적 프로파일은 고환 절제술에서 얻은 진단 조직과 비교됩니다. 우리는 이미 전립선암 프로젝트의 일환으로 실험실에서 Biomodal 플랫폼을 성공적으로 구현했습니다. 또한, 우리는 1%까지 신뢰할 수 있는 변이 감지를 가능하게 하는 ctDNA 특이적 엑솜 농축 키트를 평가했습니다. 엑솜 및 Biomodal 데이터 세트를 분석하는 모든 생물정보학 도구는 그라츠 의과대학 인간유전학연구소에서 잘 확립되어 있습니다.