미숙아의 타액 펩티드에 대한 통합 단백질 HPLC-ESI-MS 분석: 파일럿 연구

배경

인간 태아 발달에 대한 연구는 실험 계획과 표본 수집이 윤리적으로 허용되는 어려움으로 인해 방해를 받습니다. 지난 몇 년 동안 미숙아의 타액 분석은 윤리적으로 허용되는 방식으로 인간 태아 발달을 조사하는 강력한 도구임이 입증되었습니다[1]. 타액 샘플 수집은 매우 조산한 신생아의 웰빙과 생존을 위해 Neonatology Unity 직원이 일반적으로 수행하는 비침습적 절차입니다. 수집된 샘플은 일반적으로 퇴원하지만, 부모 중 한 사람의 정보에 입각한 동의 후 분석은 태아의 마지막 몇 달 동안 발생하는 분자 이벤트를 조사하는 데 중요할 수 있습니다.

실제로, 이전의 HPLC-ESI-MS 분석은 다른 월경 후 연령(PMA)의 신생아로부터 수집한 타액 샘플에 대해 수행되었으며, 40개 이상의 단백질이 높은 수준으로 존재함을 입증했으며, 그 중 다수는 S100 단백질 계열에 속하며, 그 양은 감소했습니다. PMA [1]에 따르면. 일반적으로 이러한 단백질은 정상적인 분만 기간 및 성인 타액에서 MS 장치의 민감도 한계에 가까운 농도로 없거나 존재합니다. 생후 1년 동안 이 단백질은 성인의 타액에 존재하는 단백질로 서서히 대체됩니다[2]. PMA 180-190일에 미숙아에서 나타나는 최초의 성인 타액 단백질은 PRB3 유전자좌에 의해 발현되는 글리코실화된 기본 프롤린 풍부 단백질과 함께 PRH2 유전자좌에 의해 암호화된 산성 프롤린 풍부 단백질(aPRPs) 이소형입니다. 히스타틴, 스타테린 및 P-B 펩타이드에 의한 PCA 210-220일에. PRH1 유전자좌에 의해 암호화된 산성 프롤린이 풍부한 단백질은 정상 분만 후 1주에서 3주 사이에 아기의 전체 타액에 나타났고, S형 시스타틴은 1세(±3개월)에 나타났고, 염기성 프롤린이 풍부한 단백질은 4세 이후에 나타났습니다. 세(±1세)이고 사춘기 이후 성인에서 관찰되는 수준에 도달합니다[2]. 인간 성인 타액에 특이적인 이러한 단백질 군은 주요 타액선(귀밑샘, 턱밑샘 및 설하샘)에 의해 다르게 분비되며 분비 과정 중에 다양한 효소(즉, 키나아제 및 단백분해효소)의 작용 하에 여러 번역 후 변형(post-translational modification, PTM)을 거치게 됩니다. ) 다른 외분비 및 내분비 기관에 공통적이다[3-6]. 우리 연구 그룹이 수행한 연구는 예를 들어 aPRP, 히스타틴 1, 스타테린 및 S의 인산화를 담당하는 많은 장기 및 조직에서 다양한 기질의 인산화에 관여하는 다면적 골지 키나제인 Fam20C의 활성이 있음을 보여주었습니다. 유형(타액) 시스타틴은 PMA 180일에 활성화되지 않습니다. 약 2세의 성인에 필적하는 수치에 도달하는 활동을 천천히 증가시킵니다[2,8]. 대신, S100A9의 인산화에 관여하는 MAPK14는 PMA 180일의 조산아에서도 태어날 때부터 완전히 활성화되었습니다[2]. 이 연구는 또한 타액 단백질의 단백질 분해에 관여하는 단백질 분해 효소가 미숙아에서 더 활동적임을 시사했습니다.

연구의 목적

이 연구의 목적은 특히 단백질 분해 또는 산화 활성이 있는 효소와 관련하여 정확한 특성 규명을 위해 미숙아 타액에서 검출할 수 있는 여러 펩타이드 및 단백질의 시간 경과에 따른 구조 및 상대적인 양을 확립하는 것입니다. 산화 스트레스와 단백질 분해는 기관지폐 이형성증 및 미숙아 망막병증과 같은 조산아의 병리학적 상태와 관련된 잘 알려진 병인 메커니즘입니다[9-11]. 이러한 병리학적 상태의 유병률로 확인된 효소의 시간 경과에 따른 상이한 발현의 상관관계도 평가될 수 있으며, 병리학적 마커로서 이러한 펩티드의 유용성을 확인하기 위한 향후 연구 목표의 기초를 나타냅니다. 활용되는 프로테오믹 접근법은 온전한 타액 프로테옴의 분석에 전념하는 하향식 플랫폼을 기반으로 하는 표적 ESI 질량 분석법이 될 것입니다.

재료 및 방법

설정 신생아 등록 및 타액 샘플 수집은 로마의 Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS의 복합 신생아학 부서에서 수행됩니다. 수집된 타액 샘플의 처리 및 단백질 분석은 로마 성심 가톨릭 대학의 기본 생명공학, 집중 및 수술 전후 관리 과학과에서 수행됩니다.

Proteomics and Metabolomics Unit of IRCCS-Fondazione Santa Lucia of Rome, 생명 및 환경 과학부, Cagliary University 의료 과학 및 공중 보건부의 병리 해부학 섹션 및 "Giulio Natta"화학 과학 및 기술 연구소 - 국립연구회는 타액 샘플 분석 및 데이터 처리에 기여할 것입니다.

연구 모집단 및 포함 기준 연구는 1964년 헬싱키 선언에 규정된 윤리적 기준에 따라 수행될 것입니다. 모든 규칙을 준수하고 기증자 또는 각 아동의 부모가 서면 동의서에 서명합니다. 윤리적 이유로 타액은 샘플 수집이 스트레스를 유발하지 않는 경우에만 수집됩니다.

신생아 집중 치료실(NICU)에 입원한 재태 연령이 175-216일(25-30주) 사이인 미숙아가 이 연구에 등록됩니다. 타액 샘플은 출생일로부터 적어도 7일 및 PMA의 최대 40주(286일) 또는 더 일찍 발생하는 경우 퇴원까지 수집됩니다. 주요 선천성 기형 또는 산전 감염이 있는 유아는 연구에서 제외됩니다.

이것은 파일럿 연구이므로 펩티드 특성화의 "사전 발견" 단계에서는 샘플 크기 계산이 배제됩니다.

그러나 적절한 시기에 등록할 수 있는 환자의 수를 추정하는 것은 가능합니다. 3%)가 사망한 경우, 약 18개월 동안 최소 30명의 영아를 연구할 가능성을 추정할 수 있습니다.

우리가 연구하려는 영아의 수는 파일럿 연구에 대한 문헌 증거와 일치합니다[12].

샘플 수집 및 치료 전체 타액이 입의 전방 바닥으로 흘러들어갈 때 부드러운 플라스틱 흡인기로 수집됩니다. 수집 후 각 타액 샘플은 즉시 얼음 욕조에서 0.2% 수성 2,2,2-트리플루오로아세트산(TFA)으로 1:1(v/v)로 희석됩니다. 그런 다음 용액을 8000g에서 5분(4°C) 동안 원심분리합니다. 마지막으로, 산성 상층액은 펠릿에서 분리되고 HPLC-ESI-MS 장치로 즉시 분석되거나 분석될 때까지 -80°C에서 저장됩니다.

RP-HPLC-ESI-MS 분석 저해상도(1/6000) MS 실험의 경우 HPLC-ESI-IT-MS 장치는 T 스플리터로 포토 다이오드 어레이 검출기에 연결된 Surveyor HPLC 시스템(ThermoFisher Scientific)이 됩니다. LCQ Advantage 이온 트랩 질량 분석기(ThermoFisher Scientific)에 연결합니다.

고해상도 분석은 Nano-HPLC-nanoESI-Orbitrap Elite 장비를 사용하여 수행됩니다. (써모 피셔 사이언티픽). 주입 부피는 샘플당 총 단백질 함량 1μg에 해당하는 5μL입니다.

MS 분석 저해상도 평균 ESI-MS 및 ESI-MS/MS 스펙트럼의 Deconvolution은 HPLC-MS 장치 관리 소프트웨어(Xcalibur 2.0.7 SP1, Thermo Fisher Scientific)에서 자동으로 수행됩니다.

상향식 분석에서 얻은 MS 및 MS/MS 데이터는 Swiss-Prot Homo Sapiens 프로테옴(UniProtKb, Swiss-Prot, 호모 사피엔스).

손상되지 않은 단백질/펩티드 특성화 및 상대적 정량화 조사된 다양한 타액 단백질 및 단백질 형태는 통합 단백질체 플랫폼을 통해 특성화됩니다. [1] 타액 표본의 타액 펩티드 및 단백질 정량 분석은 저해상도 HPLC-ESI-MS eXtracted Ion Current(XIC) 피크 면적(신호/노이즈 비율 >5)의 측정을 기반으로 합니다. XIC 검색은 총 이온 전류(TIC) 크로마토그래피 프로필을 따라 ESI 소스에서 생성된 특정 다중 하전 이온(m/z)의 이온 전류 강도를 추출하여 관심 단백질과 관련된 피크를 나타냅니다. 단백질과 펩티드를 정량화하는 데 사용되는 이온은 대략 단백질 질량에 비례하는 수로 선택되며 다른 공동 용출 펩티드와 공통된 값을 제외하도록 신중하게 선택됩니다. XIC 피크의 면적은 단백질/펩티드 농도에 비례합니다. 따라서 일정한 분석 조건 하에서 정량 분석 ​​및 비교 연구에 사용할 수 있다[13-14]. XIC 절차의 예상 백분율 오류는 <10%입니다.

통계 분석 펩타이드 및 단백질 측면에서 타액의 특성화는 정량적 매개변수에 대한 평균 및 표준 편차와 함께 설명됩니다. 시간이 지남에 따라(생일에서 40주까지) 특성화가 어떻게 변하는지 테스트하고 반복 측정에 대한 분산 분석을 통해 중요한 차이를 평가합니다.

참조

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