Integrovaná proteomická HPLC-ESI-MS analýza slinných peptidů předčasně narozených novorozenců: pilotní studie

Pozadí

Studiu vývoje lidského plodu brání obtížnost mít plán experimentu a odběr vzorků eticky přijatelné. V minulých letech se ukázalo, že analýza slin předčasně narozených novorozenců je mocným nástrojem pro zkoumání vývoje lidského plodu eticky přijatelným způsobem [1]. Odběr vzorků slin je skutečně neinvazivní procedura, kterou obvykle provádí pracovníci Neonatologické jednoty pro pohodu a přežití vysoce předčasně narozených novorozenců. Odebrané vzorky jsou obvykle vypouštěny, přičemž jejich analýza po informovaném souhlasu jednoho z rodičů může být cenná pro vyšetření molekulárních událostí, ke kterým dochází v posledních měsících života plodu.

Předchozí analýzy HPLC-ESI-MS provedené na vzorcích slin odebraných novorozencům v různém postmenstruačním věku (PMA) skutečně prokázaly přítomnost vysokých hladin více než 40 proteinů, z nichž mnohé patří do rodiny proteinů S100, což snižuje jejich množství. podle PMA [1]. Obvykle tyto proteiny buď chybí, nebo jsou přítomny v koncentraci blízké hranici citlivosti našeho RS aparátu při normálním termínu porodu a ve slinách dospělých. V prvních letech života jsou tyto proteiny pomalu nahrazovány proteinem přítomným ve slinách dospělého člověka [2]. První dospělé slinné proteiny, které se objevují u předčasně narozených novorozenců ve 180-190 dnech PMA, jsou izoformy kyselých proteinů bohatých na prolin (aPRPs) kódované lokusem PRH2 spolu s glykosylovaným bazickým proteinem bohatým na prolin exprimovaným lokusem PRB3. při 210-220 dnech PCA histatiny, statherinem a P-B peptidem. Kyselé proteiny bohaté na prolin kódované lokusem PRH1 se objevily v celých slinách miminek 1 až 3 týdny po normálním termínu porodu, cystatiny typu S se objevily po 1 roce (±3 měsíce) a bazické proteiny bohaté na prolin se objevily po 4. let (±1 rok) věku a dosahují úrovně pozorované u dospělého po pubertě [2]. Tyto proteinové rodiny specifické pro lidské sliny dospělých jsou rozdílně vylučovány hlavními slinnými žlázami (příušní, submandibulární a sublingvální) a během procesu sekrece podléhají několika posttranslačním modifikacím (PTM) působením různých enzymů (např. kináz a proteináz). ) společné pro jiné exokrinní a endokrinní orgány [3-6]. Studie provedené naší výzkumnou skupinou například ukázaly, že aktivita Fam20C, pleitropní Golgi kinázy zapojená do fosforylace mnoha různých substrátů v mnoha orgánech a tkáních [7], odpovědná za fosforylaci aPRP, histatinu 1, statherinu a S Cystatiny -typu (slinné) nejsou aktivní po 180 dnech PMA. Pomalu zvyšuje svoji aktivitu a zhruba ve 2 letech dosahuje hodnot srovnatelných s dospělými [2,8]. Místo toho byla MAPK14 zapojená do fosforylace S100A9 plně aktivní od narození také u předčasně narozených novorozenců po 180 dnech PMA [2]. Tyto studie také naznačovaly, že proteinázy zapojené do proteolýzy slinných proteinů byly aktivnější u předčasně narozených novorozenců.

Cíl studie

Cílem studie bude stanovit strukturu a relativní množství v čase několika peptidů a proteinů detekovatelných v předčasných slinách, které stále čekají na přesnou charakterizaci, zejména s ohledem na enzymy s proteolytickou nebo oxidativní aktivitou. Oxidační stres a proteolýza jsou dobře známé patogenetické mechanismy podílející se na patologických stavech předčasně narozených dětí, jako je bronchopulmonální dysplazie a retinopatie nedonošených [9–11]. Korelace rozdílné exprese enzymů identifikovaných v čase s prevalencí těchto patologických stavů může být také vyhodnocena a představuje základ pro budoucí studie, jejichž cílem je ověřit užitečnost takových peptidů jako patologických markerů. Použitým proteomickým přístupem bude cílená ESI hmotnostní spektrometrie založená na platformě shora dolů věnované analýze intaktního slinného proteomu.

Materiály a metody

Prostředí Zápis novorozenců a odběr vzorků slin bude prováděn na komplexní operační jednotce neonatologie Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS v Římě. Ošetření a proteomická analýza odebraných vzorků slin bude provedena na Katedře základních biotechnologických, intenzivní a perioperační péče na Katolické univerzitě Nejsvětějšího srdce Říma.

Jednotka proteomiky a metabolomiky IRCCS-Fondazione Santa Lucia v Římě, Katedra věd o životě a životním prostředí a Sekce patologické anatomie Katedry lékařských věd a veřejného zdraví Cagliary University a Ústav chemických věd a technologií „Giulio Natta“ - Národní rada pro výzkum, přispěje k analýze vzorků slin a ke zpracování dat.

Studijní populace a kritéria pro zařazení Studie bude provedena v souladu s etickými standardy stanovenými v Helsinské deklaraci z roku 1964. Budou dodržena všechna pravidla a písemný souhlas podepíše dárce nebo rodiče každého dítěte. Z etických důvodů budou sliny odebírány pouze tehdy, když odběr vzorků nezpůsobuje žádný stres.

Do této studie budou zařazeni předčasně narozené děti s gestačním věkem mezi 175-216 dny (25-30 týdny), přijaté na jednotku intenzivní péče pro novorozence (NICU). Vzorek slin bude odebrán alespoň sedm dní od data narození a až 40 týdnů (286 dní) PMA nebo až do propuštění, pokud k němu dojde dříve. Kojenci s velkými vrozenými malformacemi nebo prenatálními infekcemi budou ze studie vyloučeni.

Protože se jedná o pilotní studii, ve fázi „před objevením“ charakterizace peptidů je výpočet velikosti vzorku vyloučen.

Je však možné odhadnout počet pacientek, které mohou být zařazeny ve vhodném časovém rámci: uvážíme-li, že v roce 2020 bylo na jednotce intenzivní péče pro novorozence hospitalizováno 75 novorozenců s gestačním věkem mezi 25. a 30. týdnem a z nich 13 (17, 3 %) zemřelo, lze odhadnout možnost studia minimálně 30 kojenců po dobu přibližně 18 měsíců.

Počet kojenců, které hodláme studovat, je v souladu s literárními údaji pro pilotní studii [12].

Odběr vzorku a léčba Celé sliny budou odebírány měkkou plastovou odsávačkou, jak stékají do předního patra úst. Po odběru se každý vzorek slin okamžitě zředí 1:1 (obj./obj.) 0,2% vodnou kyselinou 2,2,2-trifluoroctovou (TFA) na ledové lázni. Roztok bude poté centrifugován při 8000 g po dobu 5 minut (4 °C). Nakonec se kyselý supernatant oddělí od pelety a buď se okamžitě analyzuje pomocí zařízení HPLC-ESI-MS nebo se až do analýzy uloží při -80 °C.

Analýza RP-HPLC-ESI-MS Pro experimenty s MS s nízkým rozlišením (1/6000) bude přístrojem HPLC-ESI-IT-MS systém Surveyor HPLC (ThermoFisher Scientific) spojený T splitterem s detektorem fotodiodového pole a buď na hmotnostní spektrometr LCQ Advantage s iontovou pastí (ThermoFisher Scientific).

Analýza s vysokým rozlišením bude provedena pomocí přístroje Nano-HPLC-nanoESI-Orbitrap Elite. (Thermo Fisher Scientific). Objem nástřiku bude 5 μl, což odpovídá 1 μg celkového obsahu bílkovin na vzorek.

MS analýza Dekonvoluce zprůměrovaných spekter ESI-MS a ESI-MS/MS s nízkým rozlišením bude automaticky provedena pomocí softwaru pro správu přístroje HPLC-MS (Xcalibur 2.0.7 SP1, Thermo Fisher Scientific).

MS a MS/MS data získaná z analýz zdola nahoru budou zpracována softwarem Proteome Discoverer 2.4 (Thermo Fisher Scientific), založeným na clusteru SEQUEST HT jako vyhledávači proti proteomu Swiss-Prot Homo Sapiens (UniProtKb, Swiss-Prot, Homo Sapiens).

Charakterizace intaktního proteinu/peptidu a relativní kvantifikace Různé zkoumané proteiny slin a jejich proteoformy budou charakterizovány pomocí integrované proteomické platformy. [1] Kvantitativní analýza peptidů a proteinů ve slinách vzorků slin bude založena na měření plochy píku extrahovaného iontového proudu (XIC) pomocí HPLC-ESI-MS s nízkým rozlišením (poměr signál/šum >5). Hledání XIC odhaluje pík spojený s proteinem zájmu extrakcí podél chromatografického profilu celkového iontového proudu (TIC) intenzity iontového proudu specifických vícenásobně nabitých iontů (m/z) generovaných zdrojem ESI. Ionty použité ke kvantifikaci proteinů a peptidů budou vybrány zhruba v počtu úměrném hmotnosti proteinu a pečlivě vybrány, aby se vyloučily hodnoty společné s jinými společně eluujícími peptidy. Plocha píku XIC je úměrná koncentraci proteinu/peptidu; proto může být za konstantních analytických podmínek použit pro kvantitativní analýzu a srovnávací studie [13-14]. Odhadovaná procentuální chyba postupu XIC je <10 %.

Statistická analýza Charakterizace slin z hlediska peptidů a proteinů bude popsána s průměry a standardními odchylkami pro kvantitativní parametry. Bude testováno, jak se charakterizace mění v průběhu času (od narozenin do 40. týdne) a jakékoli významné rozdíly budou posouzeny analýzou rozptylu pro opakovaná měření.

Reference

1. M. Castagnola, R. Inzitari, C. Fanali, F. Iavarone, A. Vitali, C. Desiderio, G. Vento, C. Tirone, C. Romagnoli, T. Cabras, B. Manconi, M.T. Sanna, R. Boi, E. Pisano, A. Olianas, M. Pellegrini, S. Nemolato, C. W. Heizmann, G. Faa, I. Messana. Překvapivé složení slinného proteomu předčasně narozeného lidského novorozence. Mol. Buňka. Proteomics 10 (2011) M110.003467.
2. Messana I, Cabras T, Iavarone F, Manconi B, Huang L, Martelli C, Olianas A, Sanna MT, Pisano E, Sanna M, Arba M, D'Alessandro A, Desiderio C, Vitali A, Pirolli D, Tirone C, Lio A, Vento G, Romagnoli C, Cordaro M, Manni A, Gallenzi P, Fiorita A, Scarano E, Calò L, Passali GC, Picciotti PM, Paludetti G, Fanos V, Faa G, Castagnola M. Chrono-proteomics of human sliny: variace slinného proteomu během lidského vývoje. J Proteome Res. 14(4) (2015) 1666-1677.
3. Castagnola M., Cabras T., Vitali A., Sanna M.T., Messana I. Biotechnologická implikace slinného proteomu. Trends Biotechnol. 29 (2011) 409-418.
4. I. Messana, T. Cabras, E. Pisano, M. T. Sanna, A. Olianas, B. Manconi, M. Pellegrini, G. Paludetti, E. Scarano, A. Fiorita, S. Agostino, A. M. Contucci, L. Calò, P. M. Picciotti, A. Manni, A. Bennick, A. Vitali, C. Fanali, R. Inzitari, M. Castagnola. Obchodování s lidmi a události po sekreci odpovědné za tvorbu secernovaných lidských slinných peptidů. Proteomický přístup. Mol. & Cell. Proteomics, 7 (2008) 911-926.
5. I. Messana, R. Inzitari, C. Fanali, T. Cabras, M. Castagnola. Fakta a artefakty v proteomice tělesných tekutin. Co nám říká proteomika slin? J. Sep. Sci. 31 (2008) 1948-1963.
6. Castagnola, M.; Cabras, T.; Iavarone, F.; Vincenzoni, F.; Vitali, A.; Pisano, E.; Nemolato, S.; Scarano, E.; Fiorita, A.; Vento, G.; Tirone, C.; Romagnoli, C.; Cordaro, M.; Paludetti, G.; Faa, G.; Messana, I. Platforma shora dolů pro dešifrování lidského slinného proteomu. J. Matern. Fetal Neonatal Med. 2012, 25 (Suppl 5), 27-43.
7. Tagliabracci VS, Wiley SE, Guo X, Kinch LN, Durrant E, Wen J, Xiao J, Cui J, Nguyen KB, Engel JL, Coon JJ, Grishin N, Pinna LA, Pagliarini DJ, Dixon JE. Jediná kináza generuje většinu vylučovaného fosfoproteomu. Buňka. 2015, 161 (7): 1619-32.
8. R. Inzitari, G. Vento, E. Capoluongo, S. Boccacci, C. Fanali, T. Cabras, C. Romagnoli, B. Giardina, I. Messana, M. Castagnola. Proteomická analýza kyselých proteinů bohatých na prolin ve slinách u lidských předčasně narozených a předčasně narozených novorozenců. J. Proteome Res. 6 (2007) 1371-1377.
9. Capasso L, Vento G, Loddo C, Tirone C, Iavarone F, Raimondi F, Dani C, Fanos V. Oxidační stres a bronchopulmonální dysplazie: Důkazy z mikrobiomiky, metabolomiky a proteomiky. Přední Pediatr. 2019, 13;7:30. doi: 10.3389/fped.2019.00030.
10. Tirone C, Iavarone F, Tana M, Lio A, Aurilia C, Costa S, Castagnola M, Messana I, Vento G. Oxidační a proteolytická inaktivace alfa-1 antitrypsinu v patogenezi bronchopulmonální dysplazie: Proteomická bronchoalveolární fluidní analýza shora dolů . Přední Pediatr. 2021, 23;9:597415. doi: 10.3389/fped.2021.597415.
11. Graziosi A, Perrotta M, Russo D, Gasparroni G, D'Egidio C, Marinelli B, Di Marzio G, Falconio G, Mastropasqua L, Li Volti G, Mangifesta R, Gazzolo D. Markery oxidativního stresu a retinopatie nedonošených. J Clin Med. 21. srpna 2020; 9 (9): 2711. doi: 10,3390/jcm9092711.
12. Julious SA. Vzorek o velikosti 12 na skupinu pro pilotní studii. Pharmaceut. Statista. 2005; 4: 287-291. DOI: 10.1002/pst.185
13. Levin, Y.; Schwarz, E.; Wang, L.; Leweke, F. M.; Bahn, S. Labelfree LC-MS/MS kvantitativní proteomika pro rozsáhlý objev biomarkerů v komplexních vzorcích. J. Sep. Sci. 2007, 30, 2198-2203.
14. Ong, S. E.; Mann, M. Proteomika založená na hmotnostní spektrometrii se mění na kvantitativní. Nat. Chem. Biol. 2005, 1, 252-262.