Integreret proteomisk HPLC-ESI-MS-analyse af spytpeptider hos præmature nyfødte: en pilotundersøgelse

Baggrund

Studiet af menneskets fosterudvikling hæmmes af vanskeligheden ved at have en eksperimentel plan og en prøvesamling etisk acceptabel. I de seneste år har analysen af ​​spyt fra præmature nyfødte vist sig at være et effektivt værktøj til at undersøge menneskets fosterudvikling på en etisk acceptabel måde [1]. Indsamlingen af ​​spytprøver er i sandhed en ikke-invasiv procedure, som normalt udføres af personalet i Neonatologienheden med henblik på velvære og overlevelse af meget for tidligt fødte nyfødte. De indsamlede prøver udskrives sædvanligvis, mens deres analyse, efter informeret samtykke fra en af ​​forældrene, kan være værdifuld for at undersøge molekylære hændelser, der opstår i de sidste måneder af fosterlivet.

Faktisk viste tidligere HPLC-ESI-MS-analyser udført på spytprøver indsamlet fra nyfødte i forskellige postmenstruelle alder (PMA) tilstedeværelsen af ​​høje niveauer af mere end 40 proteiner, hvoraf mange vedrører familien af ​​S100-proteiner, hvilket reducerede deres mængder ifølge PMA [1]. Sædvanligvis er disse proteiner enten fraværende eller til stede i en koncentration tæt på grænsen for følsomhed for vores MS-apparat ved den normale leveringstid og i spyt hos voksne. I de første leveår bliver disse proteiner langsomt erstattet af det protein, der findes i det menneskelige spyt [2]. De første voksne spytproteiner, der optræder i den præmature nyfødte efter 180-190 dage med PMA, er de sure prolin-rige proteiner (aPRP'er) isoformer kodet af PRH2-locuset sammen med et glycosyleret basisk prolin-rigt protein udtrykt af PRB3-locuset, efterfulgt ved 210-220 dage med PCA af hisstatiner, statherin og P-B-peptid. Sure prolinrige proteiner kodet af PRH1 locus optrådte i hele spyt fra babyer fra 1 til 3 uger efter den normale leveringstid, S-type cystatiner dukkede op efter 1 år (±3 måneder), og basiske prolinrige proteiner dukkede op efter 4 år (±1 år) og nå det niveau, der observeres hos den voksne efter puberteten [2]. Disse proteinfamilier, der er specifikke for humant voksenspyt, udskilles forskelligt af de store spytkirtler (parotid, submandibulær og sublingual) og underkastes under sekretionsprocessen adskillige post-translationelle modifikationer (PTM'er) under påvirkning af forskellige enzymer (dvs. kinaser og proteinaser) ) fælles for andre eksokrine og endokrine organer [3-6]. Undersøgelser udført af vores forskergruppe viste for eksempel, at aktiviteten af ​​Fam20C, en pleitropisk Golgi-kinase involveret i phosphoryleringen af ​​mange forskellige substrater i mange organer og væv [7], ansvarlig for phosphoryleringen af ​​aPRP'er, histatin 1, statherin og S -type (spyt) cystatiner er ikke aktive efter 180 dage med PMA. Det øger langsomt sin aktivitet og når værdier, der kan sammenlignes med voksne i en alder af omkring 2 år [2,8]. I stedet var MAPK14 involveret i phosphoryleringen af ​​S100A9 fuldt aktiv siden fødslen også hos præmature nyfødte efter 180 dages PMA [2]. Disse undersøgelser antydede også, at proteinaserne involveret i proteolysen af ​​spytproteiner var mere aktive hos præmature nyfødte.

Formålet med undersøgelsen

Formålet med undersøgelsen vil være at fastlægge strukturen og den relative mængde over tid af adskillige peptider og proteiner, der kan påvises i præmaturt spyt, der stadig afventer en præcis karakterisering, med særlig hensyntagen til enzymer med proteolytisk eller oxidativ aktivitet. Oxidativ stress og proteolyse er velkendte patogenetiske mekanismer involveret i patologiske tilstande hos præmature spædbørn, såsom bronkopulmonal dysplasi og retinopati hos præmaturitet [9-11]. En sammenhæng mellem den forskellige ekspression over tid af enzymerne identificeret med udbredelsen af ​​disse patologiske tilstande kan også evalueres og repræsentere grundlaget for fremtidige undersøgelser, der sigter mod at verificere anvendeligheden af ​​sådanne peptider som patologiske markører. Den anvendte proteomiske tilgang vil være en målrettet ESI-massespektrometri, baseret på en top-down platform dedikeret til analysen af ​​det intakte spytproteom.

Materialer og metoder

Indstilling Indskrivning af nyfødte og indsamling af spytprøver vil blive udført på den komplekse operative enhed for neonatologi i Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS i Rom. Behandlingen og proteomanalysen af ​​de indsamlede spytprøver vil blive udført ved Institut for grundlæggende bioteknologiske, intensive og perioperative plejevidenskaber ved det katolske universitet i Roms hellige hjerte.

Proteomics and Metabolomics Unit af IRCCS-Fondazione Santa Lucia i Rom, Institut for Livs- og Miljøvidenskab og Sektion for Patologisk Anatomi ved Institut for Medicinske Videnskaber og Folkesundhed ved Cagliary University og "Giulio Natta" Institute of Chemical Sciences and Technologies - Det Nationale Forskningsråd, vil bidrage til analyse af spytprøver og til databehandling.

Undersøgelsespopulation og inklusionskriterier Undersøgelsen vil blive udført i overensstemmelse med de etiske standarder fastlagt i Helsinki-erklæringen fra 1964. Alle regler vil blive overholdt, og skriftlige samtykkeerklæringer vil blive underskrevet af donoren eller af forældre til hvert barn. Af etiske årsager vil spyt kun blive opsamlet, når prøvetagning ikke vil forårsage stress.

For tidligt fødte spædbørn med en svangerskabsalder mellem 175-216 dage (25-30 uger), indlagt på Neonatal Intensive Care Unit (NICU), vil blive tilmeldt denne undersøgelse. Spytprøven vil blive indsamlet mindst endda syv dage fra fødselsdatoen og op til 40 uger (286 dage) med PMA eller op til udledning, hvis det sker tidligere. Spædbørn med større medfødte misdannelser eller prænatale infektioner vil blive udelukket fra undersøgelsen.

Da dette er et pilotstudie, er beregningen af ​​prøvestørrelsen udelukket i "før-opdagelsesfasen" af karakterisering af peptiderne.

Det er dog muligt at estimere antallet af patienter, der kan indskrives inden for en passende tidsramme: i betragtning af, at i 2020 blev 75 nyfødte med en gestationsalder mellem 25 og 30 uger indlagt på Neonatal Intensiv afdeling, og blandt disse 13 (17, 3%) døde, kan det estimeres muligheden for at studere mindst 30 spædbørn over en periode på cirka 18 måneder.

Antallet af spædbørn, vi har til hensigt at undersøge, er i overensstemmelse med litteraturen for et pilotstudie [12].

Prøveindsamling og -behandling Helt spyt vil blive opsamlet med en blød plastiksuger, mens det strømmede ind i den forreste bund af munden. Efter opsamling vil hver spytprøve straks blive fortyndet 1:1 (v/v) med 0,2 % vandig 2,2,2-trifluoreddikesyre (TFA) på isbad. Opløsningen centrifugeres derefter ved 8000 g i 5 minutter (4°C). Til sidst vil den sure supernatant blive adskilt fra pelleten og enten straks analyseret med HPLC-ESI-MS-apparatet eller opbevaret ved -80 °C indtil analysen.

RP-HPLC-ESI-MS-analyse Til lavopløsnings (1/6000) MS-eksperimenter vil HPLC-ESI-IT-MS-apparatet være et Surveyor HPLC-system (ThermoFisher Scientific) forbundet med en T-splitter til en fotodiode-array-detektor og enten til et LCQ Advantage ionfælde-massespektrometer (ThermoFisher Scientific).

Højopløsningsanalyse vil blive udført ved hjælp af et Nano-HPLC-nanoESI-Orbitrap Elite-instrument. (Thermo Fisher Scientific). Injektionsvolumenet vil være 5 μL svarende til 1 μg totalt proteinindhold pr. prøve.

MS-analyse Dekonvolution af gennemsnits ESI-MS- og ESI-MS/MS-spektre med lav opløsning udføres automatisk i HPLC-MS-apparatstyringssoftwaren (Xcalibur 2.0.7 SP1, Thermo Fisher Scientific).

MS- og MS/MS-data opnået fra bottom-up-analyser vil blive udarbejdet af Proteome Discoverer 2.4-software (Thermo Fisher Scientific), baseret på SEQUEST HT-klyngen som søgemaskine mod Swiss-Prot Homo Sapiens-proteomet (UniProtKb, Swiss-Prot, Homo Sapiens).

Karakterisering af intakt protein/peptid og relativ kvantificering De forskellige spytproteiner og deres proteoformer vil blive karakteriseret ved hjælp af en integreret proteomisk platform. [1] Kvantitativ spytpeptid- og -proteinanalyse af spytprøverne vil være baseret på måling af HPLC-ESI-MS-ekstraheret ionstrøm (XIC) med lav opløsning (signal/støjforhold >5). XIC-søgningen afslører toppen forbundet med proteinet af interesse ved at ekstrahere langs den totale ionstrøm (TIC) kromatografiske profil intensiteten af ​​ionstrømmen af ​​specifikke multipliceret ladede ioner (m/z) genereret af ESI-kilden. De ioner, der bruges til at kvantificere proteinerne og peptiderne, vil blive valgt groft i et antal, der er proportionalt med proteinmassen og nøje udvalgt for at udelukke værdier, der er fælles med andre co-eluerende peptider. Arealet af XIC-toppen er proportional med protein/peptidkoncentration; derfor kan den under konstante analytiske forhold bruges til en kvantitativ analyse og sammenlignende undersøgelser [13-14]. Den estimerede procentvise fejl for XIC-proceduren er <10%.

Statistisk analyse Karakteriseringen af ​​spyttet i form af peptider og proteiner vil blive beskrevet med middel og standardafvigelser for kvantitative parametre. Hvordan karakteriseringen ændrer sig over tid (fra fødselsdag - til 40 uger) vil blive testet og eventuelle signifikante forskelle vil blive vurderet gennem variansanalyse for gentagne mål.

Referencer

1. M. Castagnola, R. Inzitari, C. Fanali, F. Iavarone, A. Vitali, C. Desiderio, G. Vento, C. Tirone, C. Romagnoli, T. Cabras, B. Manconi, M.T. Sanna, R. Boi, E. Pisano, A. Olianas, M. Pellegrini, S. Nemolato, C.W. Heizmann, G. Faa, I. Messana. Den overraskende sammensætning af spytproteomet hos for tidligt fødte mennesker. Mol. Celle. Proteomics 10 (2011) M110.003467.
2. Messana I, Cabras T, Iavarone F, Manconi B, Huang L, Martelli C, Olianas A, Sanna MT, Pisano E, Sanna M, Arba M, D'Alessandro A, Desiderio C, Vitali A, Pirolli D, Tirone C, Lio A, Vento G, Romagnoli C, Cordaro M, Manni A, Gallenzi P, Fiorita A, Scarano E, Calò L, Passali GC, Picciotti PM, Paludetti G, Fanos V, Faa G, Castagnola M. Chrono-proteomics of human spyt: variationer af spytproteomet under menneskelig udvikling. J Proteome Res. 14(4) (2015) 1666-1677.
3. Castagnola M., Cabras T., Vitali A., Sanna M.T., Messana I. Bioteknologisk implikation af spytproteomet. Trends Biotechnol. 29 (2011) 409-418.
4. I. Messana, T. Cabras, E. Pisano, M.T. Sanna, A. Olianas, B. Manconi, M. Pellegrini, G. Paludetti, E. Scarano, A. Fiorita, S. Agostino, A.M. Contucci, L. Calò, P. M. Picciotti, A. Manni, A. Bennick, A. Vitali, C. Fanali, R. Inzitari, M. Castagnola. Trafficking og post-sekretoriske hændelser, der er ansvarlige for dannelsen af ​​udskilte humane spytpeptider. En proteomisk tilgang. Mol. & Celle. Proteomics, 7 (2008) 911-926.
5. I. Messana, R. Inzitari, C. Fanali, T. Cabras, M. Castagnola. Fakta og artefakter i proteomik af kropsvæsker. Hvad proteomics af spyt fortæller os? J. sep. Sci. 31 (2008) 1948-1963.
6. Castagnola, M.; Cabras, T.; Iavarone, F.; Vincenzoni, F.; Vitali, A.; Pisano, E.; Nemolato, S.; Scarano, E.; Fiorita, A.; Vento, G.; Tirone, C.; Romagnoli, C.; Cordaro, M.; Paludetti, G.; Faa, G.; Messana, I. Top-down platform til dechifrering af det menneskelige spytproteom. J. Matern. Fetal Neonatal Med. 2012, 25 (Suppl 5), 27-43.
7. Tagliabracci VS, Wiley SE, Guo X, Kinch LN, Durrant E, Wen J, Xiao J, Cui J, Nguyen KB, Engel JL, Coon JJ, Grishin N, Pinna LA, Pagliarini DJ, Dixon JE. En enkelt kinase genererer størstedelen af ​​det udskilte fosfoproteom. Celle. 2015, 161(7):1619-32.
8. R. Inzitari, G. Vento, E. Capoluongo, S. Boccacci, C. Fanali, T. Cabras, C. Romagnoli, B. Giardina, I. Messana, M. Castagnola. Proteomisk analyse af spytsyre-prolin-rige proteiner i humane præmature og forbårne nyfødte. J. Proteome Res. 6 (2007) 1371-1377.
9. Capasso L, Vento G, Loddo C, Tirone C, Iavarone F, Raimondi F, Dani C, Fanos V. Oxidativ stress og bronkopulmonal dysplasi: Beviser fra mikrobiomik, metabolomik og proteomik. Front Pediatr. 2019, 13;7:30. doi: 10.3389/fped.2019.00030.
10. Tirone C, Iavarone F, Tana M, Lio A, Aurilia C, Costa S, Castagnola M, Messana I, Vento G. Oxidativ og proteolytisk inaktivering af Alpha-1 Antitrypsin i Bronchopulmonary Dysplasia Patogenese: A Top-Down Proteomic Bronchoalveolar Analysis Lavage . Front Pediatr. 2021, 23;9:597415. doi: 10.3389/fped.2021.597415.
11. Graziosi A, Perrotta M, Russo D, Gasparroni G, D'Egidio C, Marinelli B, Di Marzio G, Falconio G, Mastropasqua L, Li Volti G, Mangifesta R, Gazzolo D. Oxidative Stress Markers and the Retinopathy of Prematurity. J Clin Med. 2020 Aug 21;9(9):2711. doi: 10.3390/jcm9092711.
12. Julious SA. Prøvestørrelse på 12 pr. gruppe tommelfingerregel for en pilotundersøgelse. Pharmaceut. Statistikker. 2005; 4: 287-291. DOI: 10.1002/pst.185
13. Levin, Y.; Schwarz, E.; Wang, L.; Leweke, F.M.; Bahn, S. Labelfree LC-MS/MS kvantitativ proteomik til storstilet biomarkøropdagelse i komplekse prøver. J. sep. Sci. 2007, 30, 2198-2203.
14. Ong, S.E.; Mann, M. Massespektrometri-baseret proteomik bliver kvantitativ. Nat. Chem. Biol. 2005, 1, 252-262.