早产儿唾液肽的综合蛋白质组学 HPLC-ESI-MS 分析：初步研究

背景

人类胎儿发育的研究因难以制定实验计划和伦理上可接受的标本采集而受到阻碍。 在过去的几年中，对早产新生儿唾液的分析被证明是一种以道德上可接受的方式研究人类胎儿发育的强大工具 [1]。 唾液样本的收集确实是一种非侵入性程序，通常由新生儿联合会的人员执行，以确保高度早产新生儿的健康和生存。 收集的样本通常会被排出，而在其中一位父母的知情同意后，他们的分析对于调查胎儿生命最后几个月发生的分子事件可能是宝贵的。

事实上，之前对从不同月经后年龄 (PMA) 的新生儿收集的唾液样本进行的 HPLC-ESI-MS 分析证明，存在高水平的 40 多种蛋白质，其中许多属于 S100 蛋白家族，减少了它们的数量根据 PMA [1]。 通常，在正常分娩期和成人唾液中，这些蛋白质要么不存在，要么浓度接近我们 MS 仪器的灵敏度极限。 在生命的最初几年，这些蛋白质会慢慢被成人唾液中存在的蛋白质所取代 [2]。 在 PMA 的 180-190 天出现在早产新生儿中的第一个成人唾液蛋白是由 PRH2 基因座编码的酸性富含脯氨酸蛋白 (aPRP) 亚型，以及由 PRB3 基因座表达的糖基化碱性富含脯氨酸蛋白，随后在 210-220 天的 PCA 中，组蛋白、富酪蛋白和 P-B 肽。 PRH1位点编码的酸性富脯氨酸蛋白在正常足月后1～3周出现在婴儿全唾液中，S型胱抑素出现在1年（±3个月），碱性富脯氨酸蛋白在4岁后出现岁（±1 岁），达到青春期后成人观察到的水平 [2]。 这些人类成人唾液特有的蛋白质家族由主要唾液腺（腮腺、下颌下腺和舌下腺）以不同方式分泌，并且在分泌过程中在各种酶（即激酶和蛋白酶）的作用下进行几种翻译后修饰（PTM） ) 常见于其他外分泌和内分泌器官 [3-6]。 例如，我们的研究小组进行的研究表明，Fam20C 的活性是一种多效性高尔基体激酶，参与许多器官和组织中许多不同底物的磷酸化 [7]，负责 aPRP、组蛋白 1、富酪蛋白和 S 的磷酸化型（唾液）胱抑素在 PMA 的 180 天时没有活性。 它会慢慢增加其活性，在大约 2 岁时达到与成人相当的值 [2,8]。 相反，参与 S100A9 磷酸化的 MAPK14 自出生后在 PMA 180 天的早产新生儿中也完全活跃 [2]。 这些研究还表明，参与唾液蛋白蛋白水解的蛋白酶在早产新生儿中更为活跃。

研究目的

该研究的目的是确定早产儿唾液中可检测到的几种肽和蛋白质随时间的结构和相对量，这些肽和蛋白质仍有待进行精确表征，特别是具有蛋白水解或氧化活性的酶。 氧化应激和蛋白水解是众所周知的致病机制，涉及早产儿的病理状况，例如支气管肺发育不良和早产儿视网膜病变 [9-11]。 还可以评估所鉴定的酶随时间的不同表达与这些病理状况的普遍性之间的相关性，并代表未来研究的基础，旨在验证此类肽作为病理标记物的效用。 使用的蛋白质组学方法将是一个有针对性的 ESI 质谱法，基于一个自上而下的平台，专门用于分析完整的唾液蛋白质组。

材料和方法

设置 新生儿的登记和唾液样本的收集将在罗马 Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS 的新生儿科复杂手术室进行。 收集的唾液样本的处理和蛋白质组学分析将在罗马圣心天主教大学的基础生物技术、重症监护和围手术期护理科学系进行。

罗马 IRCCS-Fondazione Santa Lucia 蛋白质组学和代谢组学组、卡利亚里大学医学科学与公共卫生系生命与环境科学系和病理解剖学组以及“Giulio Natta”化学科学与技术研究所- 国家研究委员会将致力于唾液样本分析和数据处理。

研究人群和纳入标准 该研究将按照 1964 年赫尔辛基宣言中规定的伦理标准进行。 将遵守所有规则，并且书面同意书将由捐赠者或每个孩子的父母签署。 出于伦理原因，只有在样本采集不会造成压力时才会采集唾液。

入住新生儿重症监护病房 (NICU) 的胎龄在 175-216 天（25-30 周）之间的早产儿将被纳入本研究。 唾液样本将在出生日期后至少 7 天和 PMA 40 周（286 天）内收集，或者如果发生时间更早，则直至出院。 患有严重先天性畸形或产前感染的婴儿将被排除在研究之外。

由于这是一项试点研究，因此在肽表征的“发现前”阶段，样本量的计算被排除在外。

但是，可以估计在适当的时间范围内可以入组的患者人数：考虑到 2020 年有 75 名胎龄在 25 至 30 周之间的新生儿在新生儿重症监护病房住院，其中 13 (17, 3%) 死亡，可以估计在大约 18 个月的时间内研究至少 30 名婴儿的可能性。

我们打算研究的婴儿人数与试点研究的文献证据一致 [12]。

样本采集和处理 当唾液流入口腔前底时，将用软塑料吸管收集全部唾液。 收集后，每个唾液样本将立即在冰浴上用 0.2% 2,2,2-三氟乙酸 (TFA) 水溶液按 1:1 (v/v) 稀释。 然后将溶液以 8000g 离心 5 分钟 (4°C)。 最后，酸性上清液将从颗粒中分离出来，并立即使用 HPLC-ESI-MS 装置进行分析或储存在 -80 °C 直至分析。

RP-HPLC-ESI-MS 分析 对于低分辨率 (1/6000) MS 实验，HPLC-ESI-IT-MS 设备将是一个 Surveyor HPLC 系统（ThermoFisher Scientific），通过 T 分离器连接到光电二极管阵列检测器和 LCQ Advantage 离子阱质谱仪 (ThermoFisher Scientific)。

将使用 Nano-HPLC-nanoESI-Orbitrap Elite 仪器进行高分辨率分析。 （赛默飞世尔科技）。 注射体积为 5 μL，对应于每个样品 1 μg 的总蛋白质含量。

低分辨率平均 ESI-MS 和 ESI-MS/MS 光谱的 MS 分析解卷积将自动执行 HPLC-MS 设备管理软件（Xcalibur 2.0.7 SP1，Thermo Fisher Scientific）。

从自下而上分析获得的 MS 和 MS/MS 数据将由 Proteome Discoverer 2.4 软件（Thermo Fisher Scientific）基于 SEQUEST HT 集群作为针对 Swiss-Prot Homo Sapiens 蛋白质组（UniProtKb、Swiss-Prot、智人）。

完整的蛋白质/肽表征和相对定量研究的不同唾液蛋白质及其蛋白质形式将通过集成蛋白质组学平台进行表征。 [1] 唾液样本的唾液肽和蛋白质定量分析将基于低分辨率 HPLC-ESI-MS 提取离子电流 (XIC) 峰面积（信噪比 >5）的测量。 XIC 搜索通过沿总离子流 (TIC) 色谱图提取 ESI 源生成的特定多电荷离子 (m/z) 的离子流强度，揭示与目标蛋白质相关的峰。 用于量化蛋白质和肽的离子将大致选择与蛋白质质量成比例的数量，并仔细选择以排除与其他共洗脱肽共有的值。 XIC 峰面积与蛋白质/肽浓度成正比；因此，在恒定的分析条件下，它可用于定量分析和比较研究[13-14]。 XIC 程序的估计百分比误差为 <10%。

统计分析 唾液在肽和蛋白质方面的特征将用定量参数的均值和标准差来描述。 将测试表征如何随时间（从生日到 40 周）发生变化，并且将通过重复测量的方差分析来评估任何显着差异。

参考

1. M. Castagnola、R. Inzitari、C. Fanali、F. Iavarone、A. Vitali、C. Desiderio、G. Vento、C. Tirone、C. Romagnoli、T. Cabras、B. Manconi、M.T. Sanna、R. Boi、E. Pisano、A. Olianas、M. Pellegrini、S. Nemolato、C.W. Heizmann、G. Faa、I. Messana。 早产人类新生儿唾液蛋白质组的惊人组成。 摩尔。 细胞。 蛋白质组学 10 (2011) M110.003467。
2. Messana I, Cabras T, Iavarone F, Manconi B, Huang L, Martelli C, Olianas A, Sanna MT, Pisano E, Sanna M, Arba M, D'Alessandro A, Desiderio C, Vitali A, Pirolli D, Tirone C, Lio A、Vento G、Romagnoli C、Cordaro M、Manni A、Gallenzi P、Fiorita A、Scarano E、Calò L、Passali GC、Picciotti PM、Paludetti G、Fanos V、Faa G、Castagnola M. 人类的计时蛋白质组学唾液：人类发育过程中唾液蛋白质组的变化。 J 蛋白质组研究。 14(4) (2015) 1666-1677。
3. Castagnola M.；Cabras T.；Vitali A.；Sanna M.T.；Messana I. 唾液蛋白质组的生物技术意义。 趋势生物技术。 29 (2011) 409-418。
4. I. Messana、T. Cabras、E. Pisano、M. T. Sanna、A. Olianas、B. Manconi、M. Pellegrini、G. Paludetti、E. Scarano、A. Fiorita、S. Agostino、A. M. Contucci、L. Calò、 P. M. Picciotti、A. Manni、A. Bennick、A. Vitali、C. Fanali、R. Inzitari、M. Castagnola。 导致分泌的人类唾液肽形成的贩运和分泌后事件。 蛋白质组学方法。 摩尔。 ＆ 细胞。 蛋白质组学，7 (2008) 911-926。
5. I. Messana、R. Inzitari、C. Fanali、T. Cabras、M. Castagnola。 体液蛋白质组学中的事实和人工制品。 唾液的蛋白质组学告诉我们什么？ J.九月。 科学。 31 (2008) 1948-1963。
6. 卡斯塔尼奥拉，M.；卡布拉斯，T。亚瓦罗内，F.；文森佐尼，F.；维塔利，A.；皮萨诺，E.；内莫拉托，S.；斯卡拉诺，E.；菲奥里塔，A.；文托，G.；蒂龙，C.；罗马尼奥利，C.； Cordaro, M.；帕鲁德蒂，G.； Faa, G.； Messana, I. 破译人类唾液蛋白质组的自上而下平台。 J. 马特恩。 胎儿新生儿医学。 2012 年，25（增刊 5），27-43。
7. Tagliabracci VS、Wiley SE、Guo X、Kinch LN、Durrant E、Wen J、Xiao J、Cui J、Nguyen KB、Engel JL、Coon JJ、Grishin N、Pinna LA、Pagliarini DJ、Dixon JE。 单个激酶产生大部分分泌的磷酸化蛋白质组。 细胞。 2015, 161(7):1619-32。
8. R. Inzitari、G. Vento、E. Capoluongo、S. Boccacci、C. Fanali、T. Cabras、C. Romagnoli、B. Giardina、I. Messana、M. Castagnola。 人类早产儿和足月新生儿唾液酸性富含脯氨酸蛋白的蛋白质组学分析。 J. 蛋白质组研究。 6 (2007) 1371-1377。
9. Capasso L、Vento G、Loddo C、Tirone C、Iavarone F、Raimondi F、Dani C、Fanos V. 氧化应激和支气管肺发育不良：来自微生物组学、代谢组学和蛋白质组学的证据。 前儿科医生。 2019 年 13 月 7 日：30。 内政部：10.3389/fped.2019.00030。
10. Tirone C、Iavarone F、Tana M、Lio A、Aurilia C、Costa S、Castagnola M、Messana I、Vento G. Alpha-1 抗胰蛋白酶在支气管肺发育不良发病机制中的氧化和蛋白水解失活：自上而下的蛋白质组学支气管肺泡灌洗液分析. 前儿科医生。 2021 年 23 日；9:597415。 内政部：10.3389/fped.2021.597415。
11. Graziosi A、Perrotta M、Russo D、Gasparroni G、D'Egidio C、Marinelli B、Di Marzio G、Falconio G、Mastropasqua L、Li Volti G、Mangifesta R、Gazzolo D. 氧化应激标志物和早产儿视网膜病变。 临床医学杂志。 2020 年 8 月 21 日；9(9)：2711。 内政部：10.3390/jcm9092711。
12. 朱利叶斯公司。 样本量为每组 12 个用于试点研究的经验法则。 药剂师。 国家主义者。 2005年； 4：287-291。 DOI：10.1002/pst.185
13. 莱文，Y。施瓦茨，E.；王，L。勒维克，F. M.； Bahn, S. Labelfree LC-MS/MS 定量蛋白质组学，用于复杂样品中大规模生物标志物的发现。 J.九月。 科学。 2007, 30, 2198-2203。
14. Ong, S. E.； Mann, M. 基于质谱的蛋白质组学转向定量。 纳特。 化学。 生物学。 2005, 1, 252-262。