Wpływ bezafibratu na metabolizm mięśniowy u pacjentów z zaburzeniami utleniania kwasów tłuszczowych (Bezafibrate)

Tło i cel badań:

Niedobory palmitoilotransferazy karnitynowej II (CPTII) i bardzo długołańcuchowej dehydrogenazy acylo-CoA (VLCAD) to dwa najczęstsze dziedziczne zaburzenia mitochondrialnego utleniania kwasów tłuszczowych (FAO) u dorosłych, oba dziedziczone w sposób autosomalny recesywny. Mitochondrialne FAO odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy energetycznej w sytuacjach takich jak post, gorączka lub długotrwałe ćwiczenia, które wymagają zarówno oszczędzania glukozy, jak i dużego zaopatrzenia w energię. W takich sytuacjach wiele tkanek, takich jak mięśnie szkieletowe, serce i wątroba, faworyzuje kwasy tłuszczowe jako główne źródło energii. Długołańcuchowe kwasy tłuszczowe (LCFA), które stanowią większą część endogennych wolnych kwasów tłuszczowych, nie mogą dostać się do przedziału macierzy mitochondrialnej na drodze prostej dyfuzji, a przenoszenie LCFA przez błony mitochondrialne jest regulowane przez multienzymatyczny system zwany palmitoilotransferazą karnitynową (CPT) składający się z dwóch enzymów: CPT I i II. CPT I, kluczowy etap regulacyjny utleniania LCFA, znajduje się w zewnętrznej błonie mitochondrialnej, podczas gdy CPT II jest przyczepiony do wewnętrznej powierzchni wewnętrznej błony mitochondrialnej. CPT I i II katalizują pojedynczą reakcję (karnityna + acylo-CoA ⇔ acylokarnityna + CoA~SH) odpowiednio w kierunku do przodu i do tyłu. VLCAD wiąże się z wewnętrzną błoną mitochondrialną i katalizuje pierwszy etap spirali β-oksydacji długołańcuchowych kwasów tłuszczowych (Izai i in., 1992).

Opisano różne fenotypy niedoborów CPT II i VLACD. Ciężkie, zagrażające życiu kliniczne objawy noworodków lub niemowląt mogą wystąpić wraz z hipoglikemią hipoketotyczną, niewydolnością wątroby i kardiomiopatią w pierwszych miesiącach lub latach życia (Demaugre i wsp., 1991; Bonnefont i wsp., 1996; Vianey-Saban i wsp. 1998; Andresen i in., 1999). I odwrotnie, „dorosłe” formy tych chorób są bardziej rozpowszechnione i mają kliniczną ekspresję ograniczoną do mięśni szkieletowych. W tej ostatniej postaci początek choroby występuje najczęściej u nastolatków lub młodych dorosłych i charakteryzuje się głównie nawracającymi epizodami rabdomiolizy wywołanymi długotrwałym wysiłkiem fizycznym, głodzeniem, przeziębieniem lub gorączką (DiMauro i wsp., 1973; Vianey-Saban i wsp. 1998) . Głównym potencjalnym powikłaniem jest ostra niewydolność nerek po napadach rabdomiolizy.

Badania wykorzystania paliwa u osób z niedoborami CPT II i VLCAD, ze stabilnymi izotopami podczas ćwiczeń, wykazały, że utlenianie LCFA in vivo było poważnie upośledzone podczas długotrwałych ćwiczeń o niskiej intensywności. Odkrycia te wskazują, że resztkowe aktywności CPT II i VLCAD są wystarczające do utrzymania normalnego utleniania tłuszczu w spoczynku, ale szybkość utleniania tłuszczu nie może wzrosnąć powyżej poziomu podstawowego podczas ćwiczeń (Ørngreen i in., 2004; 2005).

Obecnie zalecane metody leczenia długołańcuchowych zaburzeń FAO zasadniczo opierają się na podejściu dietetycznym, z ograniczeniem spożycia długołańcuchowych tłuszczów wraz z dostarczaniem trójglicerydów o średniej długości łańcucha (olej MCT). Dieta bogata w węglowodany poprawiła również tolerancję wysiłku u pacjentów z niedoborem CPT II, ​​na co wskazuje zmniejszenie odczuwanego wysiłku i wydłużenie czasu trwania ćwiczeń po takiej diecie (Ørngreen i in., 2003). Niedawno, po suplementacji diety siedmiowęglowym średniołańcuchowym kwasem tłuszczowym (triheptanoïn), nastąpiła znaczna poprawa objawów sercowych i mięśniowych u trojga dzieci z niedoborem VLCAD. Uważa się, że mechanizm leżący u podstaw tego efektu obejmuje wytwarzanie ciał ketonowych C5 i propionylo-CoA, co pozwala na uzupełnienie puli półproduktów katalitycznych dla cyklu kwasu cytrynowego (Roe i in., 2002). To obiecujące podejście jest nadal w trakcie oceny, a wyraźne skutki uboczne ze strony przewodu pokarmowego mogą ograniczyć jego wskazania do cięższej postaci defektów FAO. Podejścia farmakologiczne polegają głównie na suplementacji karnityną w celu dostarczenia karnityny w celu przekształcenia potencjalnie toksycznych długołańcuchowych acylo-CoA w acylokarnityny. Jednak rola suplementów karnityny w defektach FAO pozostaje kontrowersyjna i ma nieudowodnioną wartość ze względu na brak kontrolowanych badań.

Receptory PPARα zostały zidentyfikowane jako potencjalne cele terapii farmakologicznej niedoborów CPTII i VLCAD. PPARα jest czynnikiem transkrypcyjnym należącym do nadrodziny receptorów steroidowo-tarczycowych, który jest w stanie modyfikować ekspresję genów CPT2 i VLCAD (Lemberger i in., 1996). Djouadi i in. ustalili, że podawanie myszom kontrolnym inhibitora CPT I (etomoksir) powoduje sprzężenie zwrotne indukcji docelowych genów PPARα zaangażowanych w utlenianie kwasów tłuszczowych, takich jak średniołańcuchowe geny dehydrogenazy acylo-CoA i oksydazy acylo-CoA (Djouadi i in., 1998). Wykazano również, że PPARα reguluje konstytutywną ekspresję genu i białka CPT2 w sercu i wątrobie dorosłej myszy oraz pośredniczy w regulacji w górę genu CPT2 w odpowiedzi na fibraty w wątrobie myszy (Aoyama i in., 1998, Watanabe i in., 2000 ). U ludzi „fibratowa” klasa leków hipolipidemicznych (klofibrat, bezafibrat, gemfibrozyl, itp…) są specyficznymi ligandami PPARα, a interakcja z PPARα stanowi molekularną podstawę efektów terapeutycznych tych leków (Vamecq i in., 1999). Grupa badawcza Bastin J i Djouadi F postawiła hipotezę, że hipolipidemiczny lek bezafibrat, działający jako aktywator PPARα, może stymulować FAO w liniach komórkowych z niedoborem CPT II i VLCAD. Wykazano, że leczenie bezafibratem fibroblastów od czterech pacjentów z niedoborem CPT II z „dorosłą” postacią choroby 1) zwiększyło ilość mRNA CPT2 (+ 47 % do + 66 %) i resztkową aktywność enzymatyczną CPT II (+ 54 do + 135 %) w sposób zależny od czasu i dawki oraz 2) normalizację szybkości utleniania palmitynianu 3H i mirystynianu 3H. I odwrotnie, bezafibrat nie korygował FAO u dwóch pacjentów z „niemowlęcą” postacią niedoboru CPTII (Djouadi i in., 2003). Ponieważ kliniczna ekspresja „dorosłej” postaci niedoboru CPT2 jest ograniczona do mięśni szkieletowych, wpływ fibratów badano na FAO w próbkach mięśni od takich pacjentów. Po dostarczeniu próbek mięśni od pacjentów z „dorosłą” postacią niedoboru CPTII obserwowano je w Instytucie Miologii (P. Laforêt, B. Eymard), wykazano, że mioblasty z tych biopsji wykazywały 40% spadek FAO w porównaniu z komórkami kontrolnymi (Djouadi i in., 2003). Co więcej, wstępne traktowanie mioblastów z niedoborem CPTII bezafibratem przywróciło FAO do normalnego poziomu (Bastin i in., 2003).

Niedawno Djouadi i in. (2005) wykazali, że dodanie bezafibratu do pożywki hodowlanej indukowało zależny od dawki (do 3-krotnego) wzrost zdolności utleniania palmitynianów w fibroblastach pacjentów z miopatyczną postacią niedoboru VLCAD, ale nie u pacjentów z ciężką postacią niedoboru VLCAD. Ta biologiczna poprawa była związana z indukowanym lekiem wzrostem mRNA VLCAD (+ 44 do + 150%), białka (1,5-2-krotnie) i resztkowej aktywności enzymu (do 7,7-krotnie) w komórkach pacjentów. Bezafibrat zmniejszył również produkcję długołańcuchowych acylo-karnityn o 90% w komórkach z umiarkowanym niedoborem VLCAD. Ta sama grupa zbadała również odpowiedź na bezafibrat w zależności od genotypu w 33 fibroblastach z niedoborem VLCAD reprezentujących 45 różnych mutacji. Leczenie bezafibratem spowodowało wyraźny wzrost zdolności FAO, często prowadząc do przywrócenia prawidłowych wartości, dla 21 genotypów, które odpowiadają głównie pacjentom z fenotypem miopatii (Gobin-Limballe i in., 2007).

Sytuacja obszaru badań i wyniki badacza w tym obszarze Powyższe dane dostarczyły pierwszych dowodów na możliwy farmakologiczny wpływ agonistów PPAR na defekty FAO u ludzi. W ostatnich dwóch latach we współpracy szpitali Pitié-Salpêtrière i Necker przeprowadzono pilotażowe badanie kliniczne oceniające potencjalnie korzystny wpływ bezafibratu na postać mięśniową niedoboru CPT II (appel d'offre AFM 2004). Sześciu dorosłych pacjentów z niedoborem CPT II otrzymywało dzienną dawkę 400 mg bezafibratu przez 6 miesięcy. Kliniczna tolerancja leczenia była doskonała, a objawy mięśniowe poprawiły się u 5/6 pacjentów, zmniejszając intensywność i czas trwania bólu mięśni. Analizy in vitro przeprowadzono na limfocytach i mięśniach szkieletowych, pobranych przed badaniem i na jego końcu. LCFAO w izolowanych mitochondriach mięśniowych było silnie indukowane u 6/6 pacjentów i wykazano, że efekt ten wynika z indukowanej lekiem regulacji w górę poziomu mRNA i białka CPT2 (Djouadi i in., 2007). Jednak głównymi punktami końcowymi tego badania były głównie analizy biochemiczne i nie byliśmy w stanie jednoznacznie wykazać zmniejszenia częstości ataków rabdomiolizy ani poprawy metabolizmu mięśni in vivo.

Proponujemy ocenę wpływu bezafibratu na metabolizm podczas wysiłku fizycznego u dorosłych pacjentów z niedoborami CPT II lub VLCAD. To badanie będzie 11-miesięczną, randomizowaną, podwójnie ślepą, kontrolowaną placebo próbą krzyżową. Badanie zostanie przeprowadzone w dwóch ośrodkach: Institut de Myologie, Szpitalu Pitié-Salpêtrière we Francji oraz Neuromuscular Research Unit, Rigshospitalet, University of Copenhagen, w Danii. Ponieważ test wysiłkowy na ergometrze rowerowym po infuzji stabilnych izotopów jest prawdopodobnie najbardziej niezawodnym sposobem oceny utleniania tłuszczu in vivo, technika ta zostanie wykorzystana jako jeden z dwóch głównych wyników tego badania i główne kryterium oceny potencjalnego wpływu tego lekiem będzie szybkość utleniania tłuszczu podczas umiarkowanego obciążenia na ergometrze rowerowym.

Dwa główne wyniki oceny potencjalnego wpływu Bezafibratu to:

• Utlenianie tłuszczu i tętno generowane podczas aktywności fizycznej na ergometrze rowerowym przy stałym obciążeniu.

Oczekujemy, że utlenianie tłuszczu u pacjentów wzrośnie o współczynnik 1,7.

Wyniki drugorzędne:

• Aktywność enzymów w leukocytach
• Profil acylokarnityny
• Akcelerometr
• Wynik Borga (postrzegany wysiłek)
• Liczba epizodów mioglobinurii
• Dzienna ocena bólu mięśni (VAS)
• Dzienniczek zużycia energii (kwestionariusz Bouchardsa)

Materiał i metody:

Pacjenci To badanie będzie 9-miesięczną, randomizowaną, podwójnie ślepą, kontrolowaną placebo próbą krzyżową. Na podstawie obliczenia siły w sekcji statystyk do badania zostanie włączonych 22 pacjentów, odpowiednio 11 pacjentów z CPT II i 11 pacjentów z niedoborem VLCAD:

Dorosłe postacie niedoborów CPTII i VLCAD są chorobami bardzo rzadkimi. Dwudziestu pięciu pacjentów z niedoborem CPTII i 15 pacjentów z miopatyczną postacią niedoboru VLCAD jest obecnie obserwowanych w naszych dwóch grupach. W przypadku, gdy nie będziemy w stanie uwzględnić wystarczającej liczby pacjentów z Danii i Francji, włączymy pacjentów naszych współpracowników w Holandii i Szwecji. Wszystkie badania będą prowadzone w szpitalach Rigshospitalet i Pitié-Salpêtrière. Tylko regularne próbki krwi będą zlecane innym szpitalom, ale wyniki zostaną przesłane faksem lub pocztą bezpośrednio do sponsora lub badaczy.

Badanie zostanie przeprowadzone w dwóch ośrodkach:

1. Neuromuskulær Forskningsenhed, Rigshospitalet, Dania
2. Institut de Myologie, Szpital Pitié-Salpêtrière we Frankfurcie We współpracy z
3. Apteka Regionu Kopenhaskiego, Alice Rosendahl, Marielundvej 25, Herlev, Dania
4. Kopenhaskie Centrum Badań Mięśni, Rigshospitalet, Blegdamsvej 9, København Ø, Dania
5. Oddział GCP, szpital Bispebjerg, Bispebjerg Bakke 23, København NV, Dania

Badanie podzielone jest na cztery okresy:

• Pierwszy okres: 1 miesiąc obserwacji.
• Drugi okres: 3 miesiące leczenia Bezafibratem lub placebo.
• Trzeci okres: 2 miesiące zmywania.
• Czwarty okres: 3 miesiące leczenia Bezafibratem lub placebo (lekiem przeciwstawnym jak w drugim okresie).

Pacjenci mają wypełniać dzienne wyniki bólu mięśni (wynik VAS) i zużycia energii (kwestionariusz Bouchardsa) podczas wszystkich czterech okresów.

Pierwszy okres:

1. Przed randomizacją wszyscy pacjenci mają 1-miesięczny okres obserwacji.
2. Kinaza kreatynowa będzie mierzona regularnie w tym okresie w celu określenia stopnia uszkodzenia mięśni przed rozpoczęciem leczenia.
3. Aby określić obciążenie pracą na poziomie 50% maksymalnego poboru tlenu (VO2max) w eksperymencie, wszyscy badani wykonają test wysiłkowy z maksymalnym cyklem przyrostowym na ergometrze rowerowym pod koniec tego okresu.

Drugi i czwarty okres:

1. Osoby badane zostaną poinstruowane, aby trzy dni przed eksperymentem stosować znormalizowaną dietę bogatą w węglowodany, zawierającą 65% węglowodanów, 15% białka i 20% tłuszczu.
2. Badanie utleniania tłuszczu: Po 3-miesięcznym okresie obserwacji uczestnicy spotkają się w laboratorium o godzinie 9.00 rano. Dwa cewniki zostaną wprowadzone do żył ramienia, jeden do żyły łokciowej w celu podania stabilnego izotopu i jeden do dystalnej żyły odpromieniowej w celu pobrania krwi. Osoby badane otrzymają przygotowany wlew palmitynianu [U-13C] o stałej szybkości (0,0026 mg kg-1 min-1, przygotowany bolusem 0,085 mg kg-1 NaH13CO3, NB! nieradioaktywne i nieszkodliwe znaczniki) . Dwie godziny po rozpoczęciu wlewu izotopu, badani przechodzą cykl do wyczerpania lub przez maksymalnie 60 minut. przy obciążeniu 50-60% VO2max, jak określono wcześniej. Tętno i poziom postrzeganego wysiłku (skala Borga) będą monitorowane co drugą minutę podczas ćwiczeń. Krew i wydychane gazy do pomiarów izotopowych będą pobierane w odstępach 10-minutowych w spoczynku i podczas wysiłku. Wydychane powietrze zostanie zebrane do 15-litrowego worka Douglas, a 10 ml próbki powietrza z worków zostanie wstrzyknięte do probówek Vacutainer w celu analizy wzbogacenia w 13CO2. Próbki krwi na acylokarnityny zostaną pobrane po 30 i 60 minutach. wysiłku lub wyczerpania i trzy godziny po wysiłku. Aktywność enzymatyczna CPT II i VLCAD będzie mierzona na leukocytach. Opisany powyżej test będzie wykonywany zarówno przed, jak i po każdym okresie leczenia.
3. Pacjenci zostaną losowo podzieleni na dwie grupy, które otrzymają 3 x 200 mg bezafibratu lub placebo w drugim okresie i odwrotnie w czwartym okresie. Pacjenci i wszyscy pracownicy służby zdrowia są zaślepieni na leczenie. Randomizację przeprowadza regionalna apteka z Kopenhagi posiadająca certyfikat GMP.
4. W pierwszym dniu badania tych dwóch okresów pacjenci będą mieli pobrane próbki krwi do analizy kinazy kreatynowej, cholesterolu, trójglicerydów, lipoprotein, całkowitej długołańcuchowych kwasów tłuszczowych, całkowitej karnityny, acylokarnityny, bilirubiny, kreatyniny, aminotransferazy asparaginianowej (ASAT), alaniny aminotransferaza (ALAT), γ-glutamylotransferaza i fosfataza zasadowa.
5. Aby wskazać poziom swojej aktywności, pacjenci będą nosić przy sobie akcelerometr przez ostatnie czternaście dni każdego okresu leczenia.

Trzeci okres:

1. Dwumiesięczny okres wymywania.
2. Pomiary poziomu kinazy kreatynowej co drugi tydzień.

Analiza statystyczna

Obliczenie wytrzymałości:

Podwójnie zaślepione, losowe i krzyżowe:

(z1-α/2 + Z1-β )2 * SD2 n ≥ _________________________ d2

Z1-a/2 = 1,96; Ryzyko błędu typu 1 (α=0,05) Z1-β = 0,84; Ryzyko błędu typu 2: (1-β) = 80% SD2 = 1,25; utlenianie palmitynianu delta u czterech pacjentów z niedoborem CPT II = 1,26±1,12 (Řrngreen i in., 2005) d2 = 0,87; (MIREDIF) wzrost oksydacji palmitynianu podczas wysiłku od poziomu pacjentów z podwójną mutacją genu CPT2 do poziomu osób z pojedynczą mutacją genu CPT2. (Řrngreen i in., 2005).

(1,96 + 0,84 )2 * 1,25 n ≥ __________________________ = 11 0,87

Obliczenia siły opierają się na wcześniejszym badaniu utleniania tłuszczu u pacjentów z niedoborem CPT II. Ørngreen i wsp. 2005 W tym badaniu opisaliśmy utlenianie tłuszczu u pacjentów i nosicieli z odpowiednio dwiema i jedną mutacją genu CPT2 w porównaniu z utlenianiem tłuszczu u zdrowych osób kontrolnych. Oczekiwany wpływ bezafibratu na utlenianie tłuszczów u pacjentów z CPT II będzie różnicą między średnią wartością utleniania tłuszczu u pacjentów z niedoborem CPT II a średnią wartością utleniania tłuszczu u heterozygotycznych nosicieli jednej mutacji genu CPT2. Obliczenia siły wskazują, że należy uwzględnić liczbę 11 podmiotów. Celem jest włączenie 11 pacjentów odpowiednio z grup pacjentów z niedoborem CPT II i grup pacjentów z niedoborem VLCAD. Jeśli jakimś cudem okaże się, że nie możemy objąć tylu pacjentów. Dwie grupy zostaną połączone w jedną grupę. Można to zrobić ze względu na podobieństwo obu grup zarówno pod względem objawów, jak i utleniania tłuszczu, które jest jednym z głównych wyników podczas ćwiczeń. Ørngreen i wsp. 2005, Ørngreen i wsp. 2004 przynajmniej jeden okres leczenia, wyniki zostaną uwzględnione w danych. Różnice między terapiami u osobnika zostaną ocenione przez sparowany test t-Studenta. Wartość p < 0,05 (testowanie dwustronne) zostanie uznana za istotną.

Pacjenci

Kryteria przyjęcia:

1. Znaczący spadek aktywności CPT II lub VLCAD mierzony w limfocytach lub fibroblastach wraz z genetyczną weryfikacją niedoboru CPT II lub VLCAD.
2. Mężczyźni i kobiety w wieku 18-65 lat.
3. Wszystkie płodne samice muszą mieć ujemny wynik testu ciążowego i stosować środki antykoncepcyjne w okresie badania.

Kryteria wyłączenia:

1. Przyjmowanie konkurencyjnych leków, jak opisano w życiorysie produktu bezafibratu.
2. Zaburzenia współzawodnictwa oceniane przez sponsora lub badaczy
3. Ciąża lub laktacja w okresie leczenia fibratem

Parametry bezpieczeństwa:

• CK przed i co drugi tydzień ± jeden tydzień w okresie leczenia.
• Enzymy wątrobowe (AST, ALT, γGT, fosforan alkaliczny), bilirubina, kreatynina, cholesterol, trójglicerydy przed okresem leczenia, w 1 miesiącu ± 1 tygodniu i na koniec okresu leczenia. Próbki krwi zostaną pobrane w lokalnych szpitalach, a wyniki zostaną przesłane faksem do sponsora lub badaczy.
• Wszyscy pacjenci zostaną poinformowani o konieczności skontaktowania się z jednym z zaangażowanych lekarzy w przypadku: 1) objawów choroby lub 2) skutków ubocznych leczenia.

Następujące kroki są przestrzegane, aby zapewnić przestrzeganie zaleceń przez pacjentów podczas okresów leczenia.

• Pacjenci będą co tydzień kontaktowani mailowo lub telefonicznie, aby upewnić się, że leczenie jest przestrzegane i że nie ma objawów choroby ani skutków ubocznych leczenia.
• W przypadku, gdy jeden z pacjentów zapomni przestrzegać przepisanych leków, okres leczenia zostanie przedłużony po ocenie sponsora lub badaczy.

Narkotyki:

W tym badaniu używamy fibratu Bezafibrate. Szczegółowe informacje o działaniu i skutkach ubocznych znajdują się w załączonym pliku z charakterystyką produktu Bezafibrate.

Randomizacja i odślepienie: Wszystkie leki są dostarczane zaślepione i losowo z apteki. W przypadku wystąpienia zagrażających życiu lub innych nieakceptowalnych skutków ubocznych leczenia, pacjent może zostać odślepiony po decyzji sponsora lub badacza. Lista randomizacyjna będzie prowadzona przez sekretarkę Malene Kronborg Have i MD Tinę Dysgaard Jeppesen w Danii. Te dwie osoby są dostępne 24 godziny na dobę i nie są w inny sposób zaangażowane w badanie.