Effetto del bezafibrato sul metabolismo muscolare nei pazienti con difetti di ossidazione degli acidi grassi (Bezafibrate)

Contesto e obiettivo della ricerca:

I deficit di carnitina palmitoiltransferasi II (CPTII) e di acil-CoA-deidrogenasi a catena molto lunga (VLCAD) sono i due disturbi ereditari più comuni dell'ossidazione degli acidi grassi mitocondriali (FAO) negli adulti, entrambi ereditati con modalità autosomica recessiva. La FAO mitocondriale svolge un ruolo fondamentale per il mantenimento dell'omeostasi energetica in situazioni come il digiuno, la febbre o l'esercizio prolungato che richiedono sia risparmio di glucosio che un maggiore apporto energetico. In queste situazioni, un certo numero di tessuti come il muscolo scheletrico, il cuore e il fegato, favoriscono gli acidi grassi come principale fonte di energia. Gli acidi grassi a catena lunga (LCFA), che rappresentano la maggior parte degli acidi grassi liberi endogeni, non possono entrare nel compartimento della matrice mitocondriale per semplice diffusione e il trasferimento di LCFA attraverso le membrane mitocondriali è governato da un sistema multienzimatico chiamato carnitina palmitoiltransferasi (CPT) costituito da due enzimi: CPT I e II. CPT I, una fase regolatoria chiave dell'ossidazione LCFA, si trova all'interno della membrana mitocondriale esterna, mentre CPT II è aggiunto alla faccia interna della membrana mitocondriale interna. I CPT I e II catalizzano una singola reazione (carnitina + acil-CoA ⇔ acilcarnitina + CoA~SH) rispettivamente nelle direzioni avanti e indietro. VLCAD è legato alla membrana mitocondriale interna e catalizza la prima fase della spirale di β-ossidazione degli acidi grassi a catena lunga (Izai et al., 1992).

Sono stati descritti vari fenotipi di carenze di CPT II e VLACD. Gravi sintomi clinici neonatali o infantili potenzialmente letali possono verificarsi con ipoglicemia ipochetotica, insufficienza epatica e cardiomiopatia durante i primi mesi o anni di vita (Demaugre et al, 1991; Bonnefont et al, 1996; Vianey-Saban et al. 1998; Andresen et al., 1999). Al contrario, le forme "adulte" di queste malattie sono più diffuse e hanno un'espressione clinica ristretta al muscolo scheletrico. In quest'ultima forma, l'esordio si verifica più spesso negli adolescenti o nei giovani adulti ed è caratterizzato principalmente da episodi ricorrenti di rabdomiolisi innescati da esercizio prolungato, digiuno, raffreddore o febbre (DiMauro et al., 1973; Vianey-Saban et al. 1998). . La principale complicanza potenziale è l'insufficienza renale acuta a seguito di attacchi di rabdomiolisi.

Studi sull'utilizzo del carburante in soggetti con carenze di CPT II e VLCAD, con isotopi stabili durante l'esercizio, hanno dimostrato che l'ossidazione in vivo di LCFA era gravemente compromessa durante l'esercizio prolungato e di bassa intensità. Questi risultati hanno indicato che le attività residue di CPT II e VLCAD sono sufficienti per mantenere la normale ossidazione dei grassi a riposo, ma che il tasso di ossidazione dei grassi non può aumentare al di sopra del livello basale durante l'esercizio (Ørngreen et al., 2004; 2005).

Gli attuali trattamenti raccomandati per i disordini FAO a catena lunga si basano essenzialmente su approcci dietetici, con la limitazione dell'assunzione di grassi a catena lunga insieme all'apporto di trigliceridi a catena media (olio MCT). Una dieta ricca di carboidrati ha anche migliorato la tolleranza all'esercizio nei pazienti con deficit di CPT II, ​​come indicato dalla riduzione dello sforzo percepito e dall'aumento della durata dell'esercizio dopo tale dieta (Ørngreen et al., 2003). Più recentemente, un notevole miglioramento dei sintomi cardiaci e muscolari si è verificato in tre bambini con deficit di VLCAD, dopo l'integrazione dietetica con un acido grasso a catena media a sette atomi di carbonio (triheptanoïn). Si ritiene che il meccanismo alla base di questo effetto coinvolga la produzione di corpi chetonici C5 e propionil-CoA, che consente il rifornimento del pool di intermedi catalitici per il ciclo dell'acido citrico (Roe et al., 2002). Questo approccio promettente è ancora in fase di valutazione e marcati effetti collaterali digestivi potrebbero restringere la sua indicazione verso la forma più grave di difetti FAO. Gli approcci farmacologici sono principalmente l'integrazione di carnitina al fine di fornire carnitina per convertire gli acil-CoA a catena lunga potenzialmente tossici in acilcarnitine. Tuttavia, il ruolo degli integratori di carnitina nei difetti della FAO rimane controverso e di valore non dimostrato a causa dell'assenza di studi controllati.

I recettori PPARα sono stati identificati come potenziali bersagli per la terapia farmacologica delle carenze di CPTII e VLCAD. PPARα è un fattore di trascrizione, appartenente alla superfamiglia dei recettori per gli ormoni steroidei tiroidei, in grado di modificare l'espressione genica di CPT2 e VLCAD (Lemberger et al, 1996). Djouadi et al. stabilito che la somministrazione per controllare i topi di un inibitore CPT I (etomoxir) provoca un'induzione di feedback dei geni bersaglio PPARα coinvolti nell'ossidazione degli acidi grassi come i geni dell'acil-CoA deidrogenasi a catena media e dell'acil-CoA ossidasi (Djouadi et al, 1998). È stato anche dimostrato che PPARα regola l'espressione costitutiva del gene e della proteina CPT2 nel cuore e nel fegato del topo adulto e media l'up-regolazione del gene CPT2 in risposta ai fibrati nel fegato del topo (Aoyama et al, 1998, Watanabe et al, 2000 ). Nell'uomo, la classe "fibrato" dei farmaci ipolipemizzanti (clofibrato, bezafibrato, gemfibrozil, ecc...) sono ligandi specifici del PPARα e l'interazione con il PPARα costituisce la base molecolare degli effetti terapeutici di questi farmaci (Vamecq et al, 1999). Il gruppo di ricerca di Bastin J e Djouadi F ha ipotizzato che il farmaco ipolipemizzante bezafibrato, agendo come attivatore di PPARα, potrebbe stimolare la FAO nelle linee cellulari carenti di CPT II e VLCAD. È stato dimostrato che il trattamento con bezafibrato dei fibroblasti di quattro pazienti con deficienza di CPT II con la forma "adulta" della malattia 1) aumenta la quantità di mRNA CPT2 (+ 47 % a + 66 %) e l'attività residua dell'enzima CPT II (+ 54 % a + 135 %) in modo dipendente dal tempo e dalla dose, e 2) per normalizzare i tassi di ossidazione del 3H-palmitato e del 3H-miristato. Al contrario, il bezafibrato non ha corretto la FAO in due pazienti con la forma "infantile" di deficit di CPTII (Djouadi et al, 2003). Poiché l'espressione clinica della forma "adulta" di carenza di CPT2 è limitata al muscolo scheletrico, l'effetto dei fibrati è stato testato sulla FAO in campioni muscolari di tali pazienti. Dopo aver ricevuto campioni muscolari da pazienti con la forma "adulta" di deficit di CPTII seguiti presso l'Istituto di Miologia (P. Laforêt, B. Eymard), è stato dimostrato che i mioblasti di queste biopsie hanno mostrato una diminuzione del 40% della FAO rispetto alle cellule di controllo (Djouadi et al, 2003). Inoltre, il pretrattamento dei mioblasti carenti di CPTII con bezafibrato ha riportato la FAO a livelli normali (Bastin et al, 2003).

Più recentemente, Djouadi et al. (2005) hanno dimostrato che l'aggiunta di bezafibrato nel mezzo di coltura ha indotto un aumento dose-dipendente (fino a 3 volte) delle capacità di ossidazione del palmitato nei fibroblasti di pazienti con la forma miopatica di deficit di VLCAD, ma non di pazienti gravemente affetti. Questo miglioramento biologico era correlato agli aumenti indotti dal farmaco dell'mRNA VLCAD (+ 44 a + 150%), delle proteine ​​(1,5-2 volte) e dell'attività enzimatica residua (fino a 7,7 volte) nelle cellule dei pazienti. Il bezafibrato ha anche ridotto del 90% la produzione di acil-carnitine a catena lunga nelle cellule che ospitano un deficit moderato di VLCAD. Lo stesso gruppo ha anche studiato la risposta al bezafibrato in funzione del genotipo in 33 fibroblasti carenti di VLCAD che rappresentano 45 diverse mutazioni. Il trattamento con bezafibrato ha determinato un marcato aumento delle capacità della FAO, portando spesso al ripristino dei valori normali, per 21 genotipi che corrispondono principalmente a pazienti con fenotipo miopatico (Gobin-Limballe et al., 2007).

Situazione dell'area di ricerca e risultati dello sperimentatore in quest'area I dati di cui sopra hanno fornito la prima evidenza di un possibile effetto farmacologico degli agonisti PPAR sui difetti della FAO nell'uomo. Negli ultimi due anni è stato condotto uno studio clinico pilota per valutare i potenziali effetti benefici del bezafibrato sulla forma muscolare del deficit di CPT II in collaborazione tra gli ospedali Pitié-Salpêtrière e Necker (appel d'offre AFM 2004). Sei pazienti adulti con deficit di CPT II hanno ricevuto una dose giornaliera di 400 mg di bezafibrato per 6 mesi. La tolleranza clinica del trattamento è stata eccellente e i sintomi muscolari sono migliorati in 5/6 pazienti con una diminuzione dell'intensità e della durata della mialgia. Sono state effettuate analisi in vitro su linfociti e muscoli scheletrici, campionati prima e alla fine dello studio. LCFAO nei mitocondri muscolari isolati è stato fortemente indotto in 6/6 pazienti e questo effetto ha dimostrato di derivare dall'up-regulation indotta da farmaci dei livelli di mRNA e proteine ​​​​CPT2 (Djouadi et al., 2007). Tuttavia, i principali endpoint di questo studio erano principalmente l'analisi biochimica e non siamo stati in grado di dimostrare chiaramente una diminuzione della frequenza degli attacchi di rabdomiolisi, né un miglioramento del metabolismo muscolare in vivo.

Proponiamo di valutare l'effetto del bezafibrato sul metabolismo durante l'esercizio in pazienti adulti affetti da deficit di CPT II o VLCAD. Questo studio sarà uno studio crossover randomizzato in doppio cieco, controllato con placebo, della durata di 11 mesi. La sperimentazione sarà condotta in due centri: Institut de Myologie, Pitié-Salpêtrière Hospital in Francia e Neuromuscular Research Unit, Rigshospitalet, University of Copenhagen, in Danimarca. Poiché il test da sforzo sul cicloergometro dopo l'infusione di isotopi stabili è probabilmente il modo più affidabile per valutare l'ossidazione dei grassi in vivo, questa tecnica sarà utilizzata come uno dei due principali risultati di questo studio e come criterio principale per valutare il potenziale effetto di questo farmaco sarà il tasso di ossidazione dei grassi durante un carico di lavoro moderato sul cicloergometro.

I due esiti primari per valutare il potenziale effetto del bezafibrato sono:

• Ossidazione dei grassi e frequenza cardiaca generata durante l'attività fisica sul cicloergometro a carico di lavoro costante.

Ci aspettiamo che l'ossidazione dei grassi nei pazienti aumenti di un fattore 1,7.

Risultati secondari:

• Attività enzimatica nei leucociti
• Profilo di acilcarnitina
• Accelerometro
• Punteggio di Borg (sforzo percepito)
• Numero di episodi di mioglobinuria
• Punteggio giornaliero del dolore muscolare (VAS)
• Diario giornaliero dell'utilizzo dell'energia (questionario Bouchards)

Materiale e metodi:

Soggetti Questo studio sarà uno studio crossover di 9 mesi, randomizzato, in doppio cieco, controllato con placebo. Sulla base del calcolo della forza nella sezione delle statistiche, 22 pazienti, rispettivamente 11 pazienti con CPT II e 11 pazienti con deficit di VLCAD saranno inclusi nello studio:

Le forme adulte di carenze di CPTII e VLCAD sono malattie molto rare. Venticinque pazienti con deficit di CPTII e 15 pazienti con forma miopatica di deficit di VLCAD sono attualmente seguiti nei nostri due gruppi. Nel caso in cui non riusciamo a includere un numero sufficiente di pazienti dalla Danimarca e dalla Francia, includeremo i pazienti dei nostri collaboratori nei Paesi Bassi e in Svezia. Tutti gli studi saranno condotti presso il Rigshospitalet e l'ospedale Pitié-Salpêtrière. Solo i campioni di sangue regolari saranno esternalizzati ad altri ospedali, ma i risultati saranno inviati via fax o spediti direttamente allo sponsor o ai ricercatori.

Lo studio sarà condotto sui due centri:

1. Neuromuskulær Forskningsenhed, Rigshospitalet, Danimarca
2. Institut de Myologie, Ospedale Pitié-Salpêtrière, Francia In collaborazione con
3. Farmacia della regione di Copenaghen, Alice Rosendahl, Marielundvej 25, Herlev, Danimarca
4. Copenhagen Muscle Research Center, Rigshospitalet, Blegdamsvej 9, København Ø, Danimarca
5. Unità GCP, ospedale Bispebjerg, Bispebjerg Bakke 23, København NV, Danimarca

Lo studio è suddiviso in quattro periodi:

• Primo periodo: periodo di osservazione di 1 mese.
• Secondo periodo: 3 mesi di trattamento con bezafibrato o placebo.
• Terzo periodo: 2 mesi di lavaggio.
• Quarto periodo: 3 mesi di trattamento con bezafibrato o placebo (il farmaco opposto rispetto al secondo periodo).

I pazienti devono compilare punteggi giornalieri di dolore muscolare (punteggio VAS) e utilizzo di energia (questionario Bouchards) durante tutti e quattro i periodi.

Primo periodo:

1. Prima della randomizzazione tutti i pazienti hanno un periodo di osservazione di 1 mese.
2. La creatina chinasi verrà misurata regolarmente in questo periodo per definire il livello di danno muscolare prima del trattamento.
3. Per determinare un carico di lavoro del 50% del massimo consumo di ossigeno (VO2max) per l'esperimento, tutti i soggetti completeranno un test di esercizio del ciclo incrementale massimo su un cicloergometro alla fine di questo periodo.

Secondo e quarto periodo:

1. I soggetti verranno istruiti a seguire una dieta ricca di carboidrati standardizzata tre giorni prima dell'esperimento contenente il 65% di carboidrati, il 15% di proteine ​​e il 20% di grassi.
2. Studio sull'ossidazione dei grassi: Dopo il periodo di osservazione di 3 mesi i soggetti si incontreranno in laboratorio alle 9:00 Due cateteri verranno inseriti nelle vene del braccio, uno nella vena cubitale per l'infusione di isotopi stabili e uno nella vena cefalica distale per il prelievo di sangue. I soggetti riceveranno un'infusione innescata a velocità costante di [U-13C]-palmitato (0,0026 mg kg-1 min-1, innescata da un bolo di NaH13CO3 da 0,085 mg kg-1, NB! traccianti non radioattivi e non pericolosi) . Due ore dopo l'inizio dell'infusione dell'isotopo, i soggetti andranno in ciclo fino all'esaurimento o per un massimo di 60 min. a un carico di lavoro del 50-60% del VO2max come precedentemente determinato. La frequenza cardiaca e il livello di sforzo percepito (Borg Scale) saranno monitorati a minuti alterni durante l'esercizio. Il sangue ei gas espirati per le misurazioni degli isotopi saranno raccolti a intervalli di 10 minuti a riposo e durante l'esercizio. L'aria espirata sarà raccolta in una sacca Douglas da 15 L, e campioni di aria da 10 ml dalle sacche saranno iniettati in provette Vacutainer per l'analisi dell'arricchimento di 13CO2. I campioni di sangue per le acil carnitine saranno raccolti dopo 30 e 60 min. di esercizio o all'esaurimento e tre ore dopo l'esercizio. L'attività enzimatica di CPT II e VLCAD sarà misurata sui leucociti. Il test sopra descritto verrà eseguito sia prima che dopo ogni periodo di trattamento.
3. I pazienti saranno randomizzati in due gruppi, per ricevere 3 x 200 mg di bezafibrato o placebo nel secondo periodo e viceversa nel quarto periodo. I pazienti e tutto il personale sanitario sono accecati per il trattamento. La randomizzazione è effettuata dalla farmacia regionale certificata GMP di Copenhagen.
4. Il primo giorno di prova di questi due periodi, ai pazienti verranno prelevati campioni di sangue per analizzare creatin chinasi, colestrolo, trigliceridi, lipoproteine, acidi grassi totali a catena lunga, carnitina totale, acilcarnitine, bilirubina, creatinina, aspartato aminotransferasi (ASAT), alanina amino transferasi (ALAT), γ glutamil transferasi e fosfatasi alcalica.
5. Per indicare il loro livello di attività, i pazienti porteranno un accelerometro negli ultimi quattordici giorni di ogni periodo di trattamento.

Terzo periodo:

1. Periodo di lavaggio di due mesi.
2. Misurazioni dei livelli di creatina chinasi ogni due settimane.

analisi statistica

Calcolo della forza:

Doppio cieco, randomizzato e crossover:

(z1-α/2 + Z1-β )2 * SD2 n ≥ _________________________ d2

Z1-α/2 = 1,96; Rischio di errore di tipo 1 (α=0,05) Z1-β = 0,84; Rischio di errore di tipo 2: (1-β) = 80% SD2 = 1,25; ossidazione delta palmitato in quattro pazienti con deficit di CPT II = 1,26±1,12 (Ørngreen et al, 2005) d2 = 0,87; (MIREDIF) aumento dell'ossidazione del palmitato durante l'esercizio dal livello dei pazienti con doppia mutazione del gene CPT2 al livello dei soggetti con singola mutazione del gene CPT2. (Ørngreen et al, 2005).

(1.96 + 0.84 )2 * 1.25 n ≥ _________________________ = 11 0.87

Il calcolo della forza si basa su un precedente studio sull'ossidazione dei grassi in pazienti con deficit di CPT II. Ørngreen et al 2005 In questo studio abbiamo descritto l'ossidazione dei grassi di pazienti e portatori con rispettivamente due e una mutazione del gene CPT2 rispetto all'ossidazione dei grassi nei controlli sani. L'effetto atteso del bezafibrato sull'ossidazione dei grassi nei pazienti con CPT II dovrebbe essere la differenza tra il valore medio dell'ossidazione dei grassi nei pazienti con deficit di CPT II e il valore medio dell'ossidazione dei grassi nei portatori eterozigoti di una mutazione del gene CPT2. Il calcolo della forza indica che è necessario includere un numero di 11 soggetti. L'obiettivo è includere 11 pazienti rispettivamente dai gruppi di pazienti con deficit di CPT II e dai gruppi di pazienti con deficit di VLCAD. Se in qualche modo si scopre che non possiamo includere così tanti pazienti. I due gruppi saranno riuniti in un unico gruppo. Questo può essere fatto a causa della somiglianza dei due gruppi sia nei sintomi che nell'ossidazione dei grassi, che è uno degli esiti primari, durante l'esercizio. Ørngreen et al 2005, Ørngreen et al 2004 Dati mancanti: finché un paziente ha completato almeno un periodo di trattamento, i risultati saranno inclusi nei dati. Le differenze tra i trattamenti nell'individuo saranno valutate da un t-test di Student appaiato. Un valore p <0,05 (test a due code) sarà considerato significativo.

Pazienti

Criterio di inclusione:

1. Diminuzione significativa delle attività di CPT II o VLCAD misurate nei linfociti o nei fibroblasti, insieme alla verifica genetica del deficit di CPT II o del deficit di VLCAD.
2. Maschi e femmine di età compresa tra 18 e 65 anni.
3. Tutte le donne fertili devono avere un test di gravidanza negativo e usare anticoncezionali durante il periodo di studio.

Criteri di esclusione:

1. Ingestione di farmaci competitivi, come descritto nel curriculum del prodotto di bezafibrato.
2. Disturbi competitivi, valutati dallo sponsor o dai ricercatori
3. Gravidanza o allattamento durante il periodo di terapia con fibrati

Parametri di sicurezza:

• CK prima e ogni due settimane ± una settimana durante il periodo di trattamento.
• Enzimi epatici (AST, ALT, γGT, fosfato alcalino), bilirubina, creatinina, colesterolo, trigliceridi prima del periodo di trattamento, a 1 mese ± una settimana e alla fine del periodo di trattamento. I campioni di sangue verranno prelevati presso gli ospedali locali ei risultati verranno inviati via fax allo sponsor o agli investigatori.
• Tutti i pazienti saranno informati di contattare uno dei medici coinvolti in caso di: 1) sintomi della loro malattia o 2) effetti collaterali del trattamento.

Vengono seguiti i seguenti passaggi per garantire la compliance dei pazienti durante i periodi di trattamento.

• I pazienti verranno contattati settimanalmente via mail o telefono, per assicurarsi che il trattamento sia seguito e che non vi siano sintomi della malattia o effetti collaterali del trattamento.
• Nel caso in cui uno dei pazienti dimentichi di seguire la prescrizione dei farmaci, il periodo di trattamento sarà prolungato dopo la valutazione dello sponsor o dei ricercatori.

Droghe:

In questo studio usiamo il fibrato bezafibrato. Per informazioni dettagliate sull'effetto e sugli effetti collaterali, consultare il file allegato con il curriculum del prodotto di Bezafibrate.

Randomizzazione e apertura in cieco: tutti i farmaci vengono consegnati in cieco e randomizzati dalla farmacia. In caso di pericolo di vita o altri effetti collaterali inaccettabili del trattamento, un paziente può essere reso cieco dopo la decisione dello sponsor o dello sperimentatore. La lista di randomizzazione sarà tenuta dalla segretaria Malene Kronborg Have e dalla dottoressa Tina Dysgaard Jeppesen in Danimarca. Queste due persone sono disponibili 24 ore al giorno e altrimenti non sono coinvolte nello studio.