Účinek bezafibrátu na svalový metabolismus u pacientů s poruchami oxidace mastných kyselin (Bezafibrate)

Pozadí a cíl výzkumu:

Deficity karnitin palmitoyltransferázy II (CPTII) a acyl-CoA-dehydrogenázy s velmi dlouhým řetězcem (VLCAD) jsou dvě nejčastější dědičné poruchy mitochondriální oxidace mastných kyselin (FAO) u dospělých, obě se dědí autozomálně recesivním způsobem. Mitochondriální FAO hraje klíčovou roli při udržování energetické homeostázy v situacích, jako je půst, horečka nebo dlouhodobé cvičení, které vyžadují jak úsporu glukózy, tak velký přísun energie. V těchto situacích řada tkání, jako je kosterní sval, srdce a játra, upřednostňuje mastné kyseliny jako hlavní zdroj energie. Mastné kyseliny s dlouhým řetězcem (LCFA), které představují hlavní část endogenních volných mastných kyselin, nemohou vstoupit do mitochondriálního matrixového kompartmentu jednoduchou difúzí a přenos LCFA přes mitochondriální membrány je řízen multienzymatickým systémem zvaným karnitin palmitoyltransferáza (CPT). skládající se ze dvou enzymů: CPT I a II. CPT I, klíčový regulační krok oxidace LCFA, se nachází uvnitř vnější mitochondriální membrány, zatímco CPT II je připojen k vnitřní straně vnitřní mitochondriální membrány. CPT I a II katalyzují jedinou reakci (karnitin + acyl-CoA ⇔ acylkarnitin + CoA~SH) v dopředném a zpětném směru. VLCAD se váže na vnitřní mitochondriální membránu a katalyzuje první krok spirály β-oxidace mastných kyselin s dlouhým řetězcem (Izai et al., 1992).

Byly popsány různé fenotypy deficitů CPT II a VLACD. Těžké neonatální nebo infantilní klinické život ohrožující symptomy se mohou vyskytnout při hypoketotické hypoglykémii, selhání jater a kardiomyopatii během prvních měsíců nebo let života (Demaugre a kol., 1991; Bonnefont a kol., 1996; Vianey-Saban a kol. 1998; Andresen a kol., 1999). Naopak "dospělé" formy těchto onemocnění jsou častější a mají klinický projev omezený na kosterní svalstvo. V posledně jmenované formě se nástup nejčastěji vyskytuje u teenagerů nebo mladých dospělých a je charakterizován především opakujícími se epizodami rhabdomyolýzy vyvolanými dlouhodobým cvičením, hladověním, nachlazením nebo horečkou (DiMauro et al., 1973; Vianey-Saban et al. 1998). . Hlavní potenciální komplikací je akutní selhání ledvin po atakách rhabdomyolýzy.

Studie využití paliva u subjektů s nedostatky CPT II a VLCAD se stabilními izotopy během cvičení ukázaly, že oxidace LCFA in vivo byla vážně narušena během prodlouženého cvičení s nízkou intenzitou. Tato zjištění naznačují, že zbytkové aktivity CPT II a VLCAD jsou dostatečné k udržení normální oxidace tuku v klidu, ale že rychlost oxidace tuku se během cvičení nemůže zvýšit nad bazální úroveň (Ørngreen et al., 2004; 2005).

Současná doporučená léčba poruch FAO s dlouhým řetězcem se v podstatě opírá o dietní přístupy s omezením příjmu tuků s dlouhým řetězcem spolu s dodávkou triglyceridů se středním řetězcem (MCT olej). Dieta bohatá na sacharidy také zlepšila toleranci cvičení u pacientů s deficitem CPT II, ​​jak je indikováno snížením vnímané námahy a delším trváním cvičení po takové dietě (Ørngreen et al., 2003). V nedávné době došlo k významnému zlepšení srdečních a svalových symptomů u tří dětí s deficitem VLCAD po doplnění stravy o sedmiuhlíkovou mastnou kyselinu se středně dlouhým řetězcem (triheptanoin). Předpokládá se, že mechanismus, který je základem tohoto účinku, zahrnuje produkci ketolátek C5 a propionyl-CoA, což umožňuje doplnění zásoby katalytických meziproduktů pro cyklus kyseliny citrónové (Roe et al., 2002). Tento slibný přístup je stále ve fázi hodnocení a výrazné zažívací vedlejší účinky by mohly omezit jeho indikaci směrem k závažnější formě defektů FAO. Farmakologické přístupy jsou hlavně suplementace karnitinu za účelem poskytnutí karnitinu k přeměně potenciálně toxických acyl-CoA s dlouhým řetězcem na acylkarnitiny. Role doplňků karnitinu u defektů FAO však zůstává kontroverzní a má neprokázanou hodnotu kvůli absenci kontrolovaných studií.

Receptory PPARa byly identifikovány jako potenciální cíle pro farmakologickou terapii deficitů CPTII a VLCAD. PPARα je transkripční faktor, patřící do nadrodiny receptorů steroidních hormonů štítné žlázy, který je schopen modifikovat expresi genů CPT2 a VLCAD (Lemberger et al, 1996). Djouadi a kol. prokázali, že podávání inhibitoru CPT I (etomoxir) kontrolním myším způsobuje zpětnovazební indukci cílových genů PPARa zapojených do oxidace mastných kyselin, jako jsou geny acyl-CoA dehydrogenázy a acyl-CoA oxidázy se středně dlouhým řetězcem (Djouadi et al, 1998). Bylo také ukázáno, že PPARα reguluje konstitutivní expresi genu a proteinu CPT2 v srdci a játrech dospělých myší a zprostředkovává up-regulaci genu CPT2 v reakci na fibráty v myších játrech (Aoyama et al, 1998, Watanabe et al, 2000 ). U lidí je „fibrátová“ třída hypolipidemik (klofibrát, bezafibrát, gemfibrozil atd...) specifickými ligandy PPARα a interakce s PPARα tvoří molekulární základ terapeutických účinků těchto léků (Vamecq et al, 1999). Výzkumná skupina Bastina J a Djouadiho F předpokládala, že hypolipidemické léčivo bezafibrát, působící jako aktivátor PPARα, může stimulovat FAO v buněčných liniích s deficitem CPT II a VLCAD. Bylo prokázáno, že léčba bezafibrátem na fibroblasty od čtyř pacientů s deficitem CPT II s „dospělou“ formou onemocnění 1) zvýšila množství mRNA CPT2 (+ 47 % až + 66 %) a zbytkovou aktivitu enzymu CPT II (+ 54 % až + 135 %) způsobem závislým na čase a dávce a 2) k normalizaci rychlosti oxidace 3H-palmitátu a 3H-myristátu. Naopak bezafibrát neupravil FAO u dvou pacientů s „infantilní“ formou deficitu CPTII (Djouadi et al, 2003). Protože klinická exprese "dospělé" formy deficitu CPT2 je omezena na kosterní svalstvo, byl účinek fibrátů testován na FAO ve svalových vzorcích od těchto pacientů. Po poskytnutí vzorků svalů od pacientů s „dospělou“ formou deficitu CPTII následovali v Myologickém ústavu (P. Laforêt, B. Eymard), bylo prokázáno, že myoblasty z těchto biopsií vykazovaly 40% pokles FAO ve srovnání s kontrolními buňkami (Djouadi et al, 2003). Navíc předběžné ošetření myoblastů s deficitem CPTII bezafibrátem obnovilo FAO na normální hladiny (Bastin et al, 2003).

Nedávno Djouadi et al. (2005) prokázali, že přidání bezafibrátu do kultivačního média vyvolalo na dávce závislé (až 3násobné) zvýšení oxidačních kapacit palmitátu ve fibroblastech od pacientů s myopatickou formou deficitu VLCAD, ale ne u těžce postižených pacientů. Toto biologické zlepšení souviselo s lékem indukovaným zvýšením mRNA VLCAD (+ 44 až + 150 %), proteinu (1,5-2krát) a reziduální enzymové aktivity (až 7,7krát) v buňkách od pacientů. Bezafibrát také snížil produkci acylkarnitinů s dlouhým řetězcem o 90 % v buňkách se středním deficitem VLCAD. Stejná skupina také zkoumala odpověď na bezafibrát jako funkci genotypu u 33 VLCAD-deficientních fibroblastů reprezentujících 45 různých mutací. Léčba bezafibrátem vedla k výraznému zvýšení kapacit FAO, což často vedlo k obnovení normálních hodnot, u 21 genotypů, které převážně odpovídají pacientům s myopatickým fenotypem (Gobin-Limballe et al., 2007).

Situace v oblasti výzkumu a výsledky výzkumníka v této oblasti Výše ​​uvedená data poskytla první důkaz o možném farmakologickém účinku agonistů PPAR na defekty FAO u lidí. V posledních dvou letech byla ve spolupráci nemocnic Pitié-Salpêtrière a Necker provedena pilotní klinická studie hodnotící potenciální příznivé účinky bezafibrátu na svalovou formu deficitu CPT II (appel d'offre AFM 2004). Šest dospělých pacientů s deficitem CPT II dostávalo denní dávku 400 mg bezafibrátu po dobu 6 měsíců. Klinická tolerance léčby byla vynikající a svalové symptomy se zlepšily u 5/6 pacientů se snížením intenzity a trvání myalgie. In vitro analýzy byly provedeny na lymfocytech a kosterním svalu, odebraným před a na konci studie. LCFAO v izolovaných svalových mitochondriích byl silně indukován u 6/6 pacientů a bylo prokázáno, že tento účinek je výsledkem lékem indukované up-regulace mRNA a hladin proteinu CPT2 (Djouadi et al., 2007). Hlavními cílovými body této studie však byla především biochemická analýza a nebyli jsme schopni jasně prokázat snížení frekvence záchvatů rabdomyolýzy, ani zlepšení svalového metabolismu in vivo.

Navrhujeme zhodnotit účinek bezafibrátu na metabolismus při zátěži u dospělých pacientů postižených deficitem CPT II nebo VLCAD. Tato studie bude 11měsíční, randomizovaná, dvojitě zaslepená, placebem kontrolovaná zkřížená studie. Zkouška bude provedena ve dvou centrech: Institut de Myologie, nemocnice Pitié-Salpêtrière ve Francii a neuromuscular Research Unit, Rigshospitalet, University of Copenhagen, Dánsko. Vzhledem k tomu, že zátěžový test na cyklovém ergometru po infuzi stabilních izotopů je pravděpodobně nejspolehlivějším způsobem hodnocení oxidace tuku in vivo, bude tato technika použita jako jeden ze dvou hlavních výsledků této studie a hlavní kritéria pro posouzení potenciálního účinku tohoto lékem bude rychlost oxidace tuku při mírném pracovním zatížení na cykloergometru.

Dva primární výsledky pro posouzení potenciálního účinku Bezafibrátu jsou:

• Oxidace tuků a srdeční frekvence generované během fyzické aktivity na cykloergometru při konstantní zátěži.

Očekáváme, že oxidace tuků u pacientů vzroste faktorem 1,7.

Sekundární výsledky:

• Enzymová aktivita v leukocytech
• Profil acylkarnitinu
• Akcelerometr
• Borgovo skóre (vnímaná námaha)
• Počet epizod myoglobinurie
• Denní skóre svalové bolesti (VAS)
• Denní deník využití energie (Bouchardsův dotazník)

Materiály a metody:

Subjekty Tato studie bude 9měsíční, randomizovaná, dvojitě zaslepená, placebem kontrolovaná, zkřížená studie. Na základě výpočtu síly v sekci statistiky bude do studie zařazeno 22 pacientů, respektive 11 pacientů s CPT II a 11 pacientů s deficitem VLCAD:

Dospělé formy nedostatků CPTII a VLCAD jsou velmi vzácná onemocnění. V našich dvou skupinách je aktuálně sledováno 25 pacientů s deficitem CPTII a 15 pacientů s myopatickou formou deficitu VLCAD. V případě, že se nám nepodaří zahrnout dostatek pacientů z Dánska a Francie, zařadíme pacienty od našich spolupracovníků z Nizozemí a Švédska. Všechny studie budou prováděny v Rigshospitalet a Pitié-Salpêtrière Hospital. Pouze pravidelné vzorky krve budou zadávány do jiných nemocnic, ale výsledky budou zaslány faxem nebo poštou přímo sponzorovi nebo vyšetřovatelům.

Studie bude provedena ve dvou centrech:

1. Neuromuskulær Forskningsenhed, Rigshospitalet, Dánsko
2. Institut de Myologie, Pitié-Salpêtrière Hospital, Frankrig Ve spolupráci s
3. Copenhagen Region Pharmacy, Alice Rosendahl, Marielundvej 25, Herlev, Dánsko
4. Copenhagen Muscle Research Center, Rigshospitalet, Blegdamsvej 9, København Ø, Dánsko
5. Jednotka GCP, nemocnice Bispebjerg, Bispebjerg Bakke 23, København NV, Dánsko

Studium je rozděleno do čtyř období:

• První období: 1 měsíční období pozorování.
• Druhé období: 3 měsíce léčba buď Bezafibrátem nebo placebem.
• Třetí období: 2 měsíce vymývání.
• Čtvrté období: 3 měsíce léčba buď Bezafibrátem nebo placebem (opačný lék než ve druhém období).

Pacienti mají vyplnit denní skóre svalové bolesti (VAS skóre) a využití energie (Bouchardsův dotazník) během všech čtyř období.

První úsek:

1. Před randomizací mají všichni pacienti 1 měsíc pozorovací období.
2. Kreatinkináza bude v tomto období pravidelně měřena, aby se určila úroveň svalového poškození před léčbou.
3. Aby bylo možné určit pracovní zátěž 50 % maximálního příjmu kyslíku (VO2max) pro experiment, všechny subjekty na konci tohoto období dokončí zátěžový test maximálního přírůstkového cyklu na cykloergometru.

Druhá a čtvrtá třetina:

1. Subjekty budou instruovány, aby tři dny před experimentem dodržovaly standardizovanou dietu bohatou na sacharidy obsahující 65 % sacharidů, 15 % bílkovin a 20 % tuku.
2. Studie oxidace tuků: Po 3 měsících pozorování se subjekty sejdou v laboratoři v 9:00. Do žil na paži budou zavedeny dva katetry, jeden do kubitální žíly pro stabilní izotopovou infuzi a jeden do distální cefalické žíly pro odběr krve. Subjektům bude podána primární infuze [U-13C]-palmitátu konstantní rychlostí (0,0026 mg kg-1 min-1, aktivovaná bolusem 0,085 mg kg-1 NaH13CO3, NB! neradioaktivní a nenebezpečné indikátory) . Dvě hodiny po začátku izotopové infuze budou subjekty cyklovat do vyčerpání nebo maximálně 60 minut. při pracovní zátěži 50-60 % VO2max, jak bylo dříve stanoveno. Srdeční frekvence a úroveň vnímané námahy (Borgova škála) budou během cvičení sledovány každou druhou minutu. Krev a vydechované plyny pro izotopová měření budou odebírány v 10minutových intervalech v klidu a během cvičení. Vydechovaný vzduch bude shromažďován v 15l vaku Douglas a 10ml vzorky vzduchu z vaků budou vstřikovány do zkumavek vacutaineru pro analýzy obohacení 13CO2. Vzorky krve na acylkarnitiny budou odebírány po 30 a 60 minutách. cvičení nebo při vyčerpání a tři hodiny po cvičení. Enzymová aktivita CPT II a VLCAD bude měřena na leukocytech. Výše popsaný test bude proveden před i po každém léčebném období.
3. Pacienti budou randomizováni do dvou skupin, které budou dostávat buď 3 x 200 mg bezafibrátu nebo placebo ve druhém období a naopak ve čtvrtém období. Pacienti a všichni zdravotníci jsou kvůli léčbě zaslepeni. Randomizaci provádí regionální lékárna v Kodani s certifikací GMP.
4. V první zkušební den těchto dvou období budou pacientům odebrány vzorky krve k analýze kreatinkinázy, cholesterolu, triglyceridů, lipoproteinů, celkových mastných kyselin s dlouhým řetězcem, celkového karnitinu, acylkarnitinu, bilirubinu, kreatininu, aspartátaminotransferázy (ASAT), alaninu. aminotransferáza (ALAT), y-glutamyltransferáza a alkalická fosfatáza.
5. K indikaci úrovně své aktivity budou mít pacienti posledních čtrnáct dní každého léčebného období u sebe akcelerometr.

Třetí perióda:

1. Dvouměsíční období vymývání.
2. Měření hladin kreatinkinázy každý druhý týden.

Statistická analýza

Výpočet síly:

Dvojitě zaslepené, randomizované a křížené:

(z1-α/2 + Z1-β )2 * SD2 n ≥ __________________________ d2

Zl-a/2 = 1,96; Riziko chyby typu 1 (α=0,05) Zl-p = 0,84; Riziko chyby typu 2: (1-β) = 80 % SD2 = 1,25; oxidace delta palmitátu u čtyř pacientů s deficitem CPT II = 1,26±1,12 (Ørngreen et al, 2005) d2 = 0,87; (MIREDIF) zvýšení oxidace palmitátu během cvičení z úrovně pacientů s dvojitou mutací genu CPT2 na úroveň subjektů s jedinou mutací genu CPT2. (Ørngreen et al, 2005).

(1,96 + 0,84 )2 * 1,25 n ≥ ___________________________ = 11 0,87

Výpočet síly je založen na dřívější studii oxidace tuků u pacientů s deficitem CPT II. Ørngreen et al 2005 V této studii jsme popsali oxidaci tuku u pacientů a přenašečů se dvěma a jednou mutací genu CPT2 ve srovnání s oxidací tuku u zdravých kontrol. Očekávaným účinkem bezafibrátu na oxidaci tuků u pacientů s CPT II je rozdíl mezi průměrnou hodnotou oxidace tuků u pacientů s deficitem CPT II a průměrnou hodnotou oxidace tuků u heterozygotních nositelů jedné mutace genu CPT2. Výpočet síly ukazuje, že je třeba zahrnout 11 subjektů. Cílem je zahrnout 11 pacientů ze skupiny pacientů s deficitem CPT II a skupiny pacientů s deficitem VLCAD. Jestli se nějak ukáže, že tolik pacientů zařadit nemůžeme. Obě skupiny budou sloučeny do jedné skupiny. Toho lze dosáhnout z důvodu podobnosti obou skupin jak v příznacích, tak v oxidaci tuků, která je jedním z primárních výsledků během cvičení.Ørngreen et al 2005, Ørngreen et al 2004 Chybějící údaje: Pokud pacient dokončil cvičení alespoň jedno léčebné období, výsledky budou zahrnuty do dat. Rozdíly mezi léčbou u jednotlivce budou hodnoceny párovým Studentovým t-testem. Hodnota p < 0,05 (dvoustranné testování) bude považována za významnou.

Pacienti

Kritéria pro zařazení:

1. Významné snížení aktivit CPT II nebo VLCAD měřených v lymfocytech nebo fibroblastech spolu s genetickým ověřením buď deficitu CPT II, ​​nebo deficitu VLCAD.
2. Muži a ženy ve věku 18-65 let.
3. Všechny fertilní ženy musí mít negativní těhotenský test a během období studie musí používat antikoncepční prostředky.

Kritéria vyloučení:

1. Požití konkurenčních léků, jak je popsáno v resumé produktu bezafibrát.
2. Kompetitivní poruchy, hodnocené sponzorem nebo zkoušejícími
3. Těhotenství nebo kojení během období fibrátové terapie

Bezpečnostní parametry:

• CK před a každý druhý týden ± jeden týden během období léčby.
• Jaterní enzymy (AST, ALT, γGT, alkalický fosfát), bilirubin, kreatinin, cholesterol, triglyceridy před léčebným obdobím, za 1 měsíc ± jeden týden a na konci léčebného období. Vzorky krve budou odebrány v místních nemocnicích a výsledky budou zaslány faxem sponzorovi nebo vyšetřovatelům.
• Všichni pacienti budou informováni, aby kontaktovali některého ze zúčastněných lékařů v případě: 1) příznaků jejich onemocnění nebo 2) nežádoucích účinků léčby.

Pro zajištění kompliance pacientů během léčebných období jsou dodržovány následující kroky.

• Pacienti budou kontaktováni každý týden poštou nebo telefonicky, aby bylo zajištěno, že léčba bude dodržována a že se neobjeví žádné příznaky onemocnění nebo vedlejší účinky léčby.
• V případě, že některý z pacientů zapomene dodržovat předepisování léků, bude doba léčby prodloužena po vyhodnocení zadavatele nebo zkoušejících.

drogy:

V této studii používáme fibrát Bezafibrát. Podrobné informace o účinku a vedlejších účincích naleznete v přiloženém souboru s resumé produktu Bezafibrate.

Randomizace a zaslepení: Všechny léky jsou dodávány zaslepené a randomizované z lékárny. Při výskytu život ohrožujících nebo jiných nepřijatelných vedlejších účinků léčby může být pacient po rozhodnutí sponzora nebo zkoušejícího odslepen. Randomizační seznam bude vést sekretářka Malene Kronborg Have a MD Tina Dysgaard Jeppesen v Dánsku. Tyto dvě osoby jsou k dispozici 24 hodin denně a jinak se do studie nezapojují.