脂肪酸酸化障害患者の筋肉代謝に対するベザフィブラートの効果 (Bezafibrate)

背景と研究目的：

カルニチン パルミトイルトランスフェラーゼ II (CPTII) および超長鎖アシル-CoA-デヒドロゲナーゼ (VLCAD) 欠損症は、成人におけるミトコンドリア脂肪酸酸化 (FAO) の 2 つの最も一般的な遺伝性疾患であり、どちらも常染色体劣性遺伝形式で遺伝します。 ミトコンドリア FAO は、断食、発熱、長時間の運動など、グルコースの節約と主要なエネルギー供給の両方が必要な状況で、エネルギーの恒常性を維持するために極めて重要な役割を果たします。 このような状況では、骨格筋、心臓、肝臓などの多くの組織が主要なエネルギー源として脂肪酸を好む. 内因性遊離脂肪酸の大部分を占める長鎖脂肪酸 (LCFA) は、単純な拡散によってミトコンドリア マトリックス コンパートメントに入ることができず、ミトコンドリア膜を通過する LCFA の移動は、カルニチン パルミトイルトランスフェラーゼ (CPT) という名前の多酵素系によって制御されます。 CPT I と II の 2 つの酵素で構成されています。 LCFA 酸化の重要な調節ステップである CPT I はミトコンドリア外膜内に位置し、CPT II はミトコンドリア内膜の内面に付加されます。 CPT I および II は、それぞれ順方向および逆方向の単一反応 (カルニチン + アシル-CoA ⇔ アシルカルニチン + CoA~SH) を触媒します。 VLCAD はミトコンドリア内膜に結合し、長鎖脂肪酸β酸化スパイラルの最初のステップを触媒します (Izai et al., 1992)。

CPT II および VLACD 欠損症のさまざまな表現型が報告されています。 重度の新生児または乳児の臨床的な生命を脅かす症状は、人生の最初の数ヶ月または数年の間に、低ケトン性低血糖症、肝不全、および心筋症で発生する可能性があります（Demaugre et al、1991; Bonnefont et al、1996; Vianey-Saban et al。1998; Andresenら、1999）。 逆に、これらの疾患の「成人」形態は、より一般的であり、骨格筋に限定された臨床的発現を有する. 後者の形態では、発症はティーンエイジャーまたは若年成人で最も頻繁に発生し、主に、長時間の運動、絶食、風邪または発熱によって引き起こされる横紋筋融解症の再発エピソードによって特徴付けられます (DiMauro et al., 1973; Vianey-Saban et al. 1998)。 . 主な潜在的な合併症は、横紋筋融解症の発作に続く急性腎不全です。

CPT II および VLCAD 欠乏症の被験者における、運動中の安定同位体による燃料利用に関する研究では、長時間の低強度運動中に LCFA の in vivo 酸化が著しく損なわれることが示されています。 これらの発見は、残りの CPT II および VLCAD 活性は、安静時に脂肪の正常な酸化を維持するのに十分であるが、脂肪の酸化率は運動中に基礎レベルを超えて増加できないことを示しました (Ørngreen et al., 2004; 2005)。

現在推奨されている長鎖 FAO 障害の治療法は、中鎖トリグリセリドの供給 (MCT オイル) とともに長鎖脂肪の摂取を制限する食事療法に基本的に依存しています。 炭水化物が豊富な食事は、CPT II 欠損患者の運動耐容能も改善しました。これは、そのような食事の後の知覚運動の低下と運動時間の増加によって示されます (Ørngreen et al., 2003)。 最近では、VLCAD 欠乏症の 3 人の子供に、炭素数 7 の中鎖脂肪酸 (トリヘプタノイン) を栄養補給した後、心臓と筋肉の症状の顕著な改善が見られました。 この効果の根底にあるメカニズムには、C5 ケトン体とプロピオニル-CoA の生成が関与すると考えられており、これによりクエン酸回路の触媒中間体のプールが補充されます (Roe et al., 2002)。 この有望なアプローチはまだ評価中であり、顕著な消化器系の副作用により、FAO 欠陥のより深刻な形態への適応が制限される可能性があります。 薬理学的アプローチは、潜在的に毒性のある長鎖アシル-CoAをアシルカルニチンに変換するカルニチンを提供するための、主にカルニチン補給です。 しかし、FAO 欠損症におけるカルニチン サプリメントの役割については、対照試験が存在しないため、依然として議論の余地があり、その価値は証明されていません。

PPARα受容体は、CPTIIおよびVLCAD欠損症の薬理学的治療の潜在的な標的として同定されました。 ＰＰＡＲαは、ステロイド甲状腺ホルモン受容体のスーパーファミリーに属する転写因子であり、ＣＰＴ２およびＶＬＣＡＤ遺伝子発現を改変することができる（Ｌｅｍｂｅｒｇｅｒら、１９９６）。 ジョアディ等。 CPT I阻害剤（エトモキシル）を対照マウスに投与すると、中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼおよびアシルCoAオキシダーゼ遺伝子などの脂肪酸酸化に関与するPPARα標的遺伝子のフィードバック誘導が引き起こされることが確立されました（Djouadi et al、1998）。 ＰＰＡＲαは、成体マウスの心臓および肝臓においてＣＰＴ２遺伝子およびタンパク質の構成的発現を調節し、マウス肝臓においてフィブラートに応答してＣＰＴ２遺伝子のアップレギュレーションを仲介することも示された（Ａｏｙａｍａら、１９９８年、Ｗａｔａｎａｂｅら、２０００年）。 ）。 ヒトでは、脂質低下薬の「フィブラート」クラス (クロフィブラート、ベザフィブラート、ゲムフィブロジルなど) が PPARα の特異的なリガンドであり、PPARα との相互作用がこれらの薬物の治療効果の分子基盤を形成します (Vamecq et al, 1999)。 Bastin J と Djouadi F の研究グループは、PPARαの活性化因子として作用する脂質低下薬のベザフィブラートが、CPT II および VLCAD 欠損細胞株で FAO を刺激する可能性があるという仮説を立てました。 「成人」型の疾患を有する 4 人の CPT II 欠損患者からの線維芽細胞のベザフィブラート治療は、1) CPT2 mRNA の量を増加させ (+ 47 % から + 66 %)、残りの CPT II 酵素活性 (+ 54 %) を増加させることが示された. % から + 135 %) を時間および用量依存的に、および 2) 3H-パルミテートおよび 3H-ミリステートの酸化速度を正規化します。 逆に、ベザフィブラートは、CPTII欠損症の「乳児」型の2人の患者でFAOを修正しませんでした（Djouadi et al、2003）. CPT2欠乏症の「成人」型の臨床的発現は骨格筋に限られているため、そのような患者の筋肉サンプルのFAOに対するフィブラートの効果がテストされました。 CPTII欠損症の「成人」型の患者から筋肉サンプルが提供された後、筋学研究所でフォローされました（P. Laforêt、B. Eymard)、これらの生検からの筋芽細胞は、対照細胞と比較して FAO が 40% 減少したことが示されています (Djouadi et al, 2003)。 さらに、CPTII欠損筋芽細胞をベザフィブラートで前処理すると、FAOが正常レベルに回復しました（Bastin et al、2003）。

最近では、Djouadi ら。 (2005) 培地にベザフィブラートを添加すると、VLCAD 欠損症のミオパシー型患者の線維芽細胞のパルミチン酸酸化能力が用量依存的に (最大 3 倍) 増加するが、重度の患者からは増加しないことが示された。 この生物学的改善は、患者の細胞における VLCAD mRNA (+ 44 から + 150%)、タンパク質 (1.5-2 倍)、および残留酵素活性 (最大 7.7 倍) の薬物誘発性の増加に関連していました。 ベザフィブラートはまた、中等度の VLCAD 欠乏症を抱える細胞において、長鎖アシルカルニチンの産生を 90% 減少させました。 同じグループは、45 の異なる変異を表す 33 の VLCAD 欠損線維芽細胞における遺伝子型の関数としてのベザフィブラートに対する応答も調査しました。 ベザフィブラートによる治療は、主にミオパシー表現型の患者に対応する 21 の遺伝子型について、FAO 容量の顕著な増加をもたらし、しばしば正常値の回復につながりました (Gobin-Limballe et al., 2007)。

研究分野の状況とこの分野の研究者による結果 上記のデータは、ヒトの FAO 欠陥に対する PPAR アゴニストの薬理学的効果の可能性に関する最初の証拠を提供しました。 過去 2 年間、CPT II 欠損症の筋肉型に対するベザフィブラートの潜在的な有益な効果を評価するパイロット臨床試験が、Pitié-Salpêtrière 病院と Necker 病院の間で共同で実施されました (appel d'offre AFM 2004)。 CPT II 欠損症の 6 人の成人患者が、6 か月間、毎日 400 mg のベザフィブラートを投与されました。 治療の臨床的耐性は優れており、5/6 の患者で筋肉症状が改善し、筋肉痛の強度と期間が減少しました。 インビトロ分析は、試験前および試験終了時にサンプリングされたリンパ球および骨格筋に対して実施された。 単離された筋肉ミトコンドリアの LCFAO は 6/6 の患者で強く誘導され、この効果は CPT2 mRNA およびタンパク質レベルの薬物誘導アップレギュレーションに起因することが示されました (Djouadi et al., 2007)。 しかし、この研究の主要なエンドポイントは主に生化学的分析であり、横紋筋融解症の発作頻度の減少も、in vivo での筋肉代謝の改善も明確に示すことができませんでした。

CPT II または VLCAD 欠損症の成人患者の運動中の代謝に対するベザフィブラートの効果を評価することを提案します。 この研究は、11 か月間の無作為化二重盲検プラセボ対照クロスオーバー試験です。 この試験は、フランスのピティエ サルペトリエール病院の Institut de Myologie とデンマークのコペンハーゲン大学 Rigshospitalet の神経筋研究ユニットの 2 つのセンターで実施されます。 安定同位体注入後のサイクル エルゴメーターでの運動テストは、おそらく in vivo での脂肪酸化を評価する最も信頼できる方法であるため、この手法は、この研究の 2 つの主要な結果の 1 つとして利用され、この潜在的な効果を評価するための主な基準となります。薬物は、サイクル エルゴメーターで適度なワークロード中の脂肪の酸化率になります。

Bezafibrate の潜在的な効果を評価するための 2 つの主要な結果は次のとおりです。

• 一定のワークロードでのサイクル エルゴメーターでの身体活動中に生成される脂肪の酸化と心拍数。

患者の脂肪の酸化は 1.7 倍に増加すると予想されます。

副次的結果:

• 白血球の酵素活性
• アシルカルニチンのプロフィール
• 加速度計
• ボーグスコア（知覚された運動）
• ミオグロビン尿症のエピソード数
• 毎日の筋肉痛スコア (VAS)
• エネルギー利用日誌（ブシャールアンケート）

材料と方法：

対象 この試験は、9 か月間の無作為化二重盲検プラセボ対照クロスオーバー試験です。 統計セクションの強度の計算に基づいて、22 人の患者、それぞれ CPT II の 11 人の患者と VLCAD 欠損症の 11 人の患者が研究に含まれます。

成人型の CPTII および VLCAD 欠損症は非常にまれな疾患です。 CPTII欠損症の25人の患者とVLCAD欠損症のミオパシー型の15人の患者が現在、2つのグループで追跡されています。 デンマークとフランスから十分な数の患者を含めることができない場合は、オランダとスウェーデンの共同研究者からの患者を含めます。 すべての研究は、Rigshospitalet および Pitié-Salpêtrière 病院で実施されます。 定期採血のみ他病院に委託し、結果は治験依頼者または研究者に直接ファクスまたは郵送する。

この研究は、次の 2 つのセンターで実施されます。

1. Neuromuskulær Forskningsenhed、Rigshospitalet、デンマーク
2. Institut de Myologie、Pitié-Salpêtrière Hospital、Frankrig との協力
3. コペンハーゲン地域薬局、Alice Rosendahl、Marielundvej 25、Herlev、デンマーク
4. コペンハーゲン筋肉研究センター、Rigshospitalet、Blegdamsvej 9、København Ø、デンマーク
5. GCP ユニット、Bispebjerg 病院、Bispebjerg Bakke 23、København NV、デンマーク

研究は4つの期間に分けられます：

• 第一期：1ヶ月の観察期間。
• 2 番目の期間: Bezafibrate またはプラセボのいずれかによる 3 か月の治療。
• 第 3 期間: 2 か月のウォッシュ アウト。
• 第 4 期：ベザフィブラートまたはプラセボ（第 2 期とは反対の薬）による 3 か月の治療。

患者は、筋肉痛の毎日のスコア (VAS スコア) とエネルギー利用 (Bouchards アンケート) を 4 つの期間すべてに記入する必要があります。

前期：

1. 無作為化の前に、すべての患者に1か月の観察期間があります。
2. クレアチンキナーゼは、治療前の筋肉損傷のレベルを定義するために、この期間に定期的に測定されます.
3. 実験の最大酸素摂取量 (VO2max) の 50% のワークロードを決定するために、すべての被験者は、この期間の終わりにサイクルエルゴメーターで最大増分サイクル運動テストを完了します。

第 2 ピリオドと第 4 ピリオド:

1. 被験者は、実験の 3 日前に、65% の炭水化物、15% のタンパク質、および 20% の脂肪を含む、標準化された高炭水化物食に従うように指示されます。
2. 脂肪酸化研究: 3 か月の観察期間の後、被験者は午前 9 時に研究室に集まります。 2本のカテーテルが腕の静脈に挿入され、1本は安定同位体注入のために肘静脈に挿入され、もう1本は採血のために遠位橈側皮静脈に挿入されます。 被験者は、プライミングされた[U-13C]-パルミテートの定速注入を受けます（0.0026 mg kg-1 min-1、0.085 mg kg-1 NaH13CO3 ボーラスでプライミング、NB! 非放射性および非危険トレーサー）。 . アイソトープ注入開始から2時間後、対象は疲労サイクルまたは最大60分間循環します。 以前に決定された VO2max の 50 ～ 60% のワークロードで。 運動中は、心拍数と知覚される運動レベル (Borg Scale) が 1 分おきに監視されます。 同位体測定のための血液および呼気ガスは、安静時および運動中に 10 分間隔で収集されます。 呼気は 15 L のダグラス バッグに収集され、バッグからの 10 ml の空気サンプルは、13CO2 濃縮の分析のためにバキュテナー チューブに注入されます。 アシルカルニチンの血液サンプルは、30および60分後に収集されます。運動中または疲労時、および運動後3時間。 CPT II および VLCAD の酵素活性は、白血球で測定されます。 上記の試験は、各治療期間の前後に実施される。
3. 患者は無作為に 2 つのグループに分けられ、2 番目の期間に 3 x 200 mg ベザフィブラートまたはプラセボのいずれかを受け取り、4 番目の期間にその逆を受け取ります。 患者およびすべての医療従事者は、治療のために盲検化されます。 無作為化は、コペンハーゲンの GMP 認定地域薬局によって行われます。
4. これらの2つの期間の最初の試験日に、患者は血液サンプルを採取して、クレアチンキナーゼ、コレステロール、トリグリセリド、リポタンパク質、総長鎖脂肪酸、総カルニチン、アシルカルニチン、ビリルビン、クレアチニン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ASAT）、アラニンを分析しますアミノ トランスフェラーゼ (ALAT)、γ グルタミル トランスフェラーゼおよびアルカリ性ホスファターゼ。
5. 活動レベルを示すために、患者は各治療期間の最後の 14 日間、加速度計を携帯します。

第3の期間：

1. 2ヶ月のウォッシュアウト期間。
2. 隔週でのクレアチンキナーゼレベルの測定。

統計分析

強度計算:

二重盲検、ランダム化、クロスオーバー:

(z1-α/2 + Z1-β )2 * SD2 n ≥ _______________________________________ d2

Z1-α/2 = 1.96; タイプ 1 エラーのリスク (α=0.05) Z1-β = 0.84;タイプ 2 のエラーのリスク: (1-β) = 80% SD2 = 1.25; CPT II欠乏症患者4人のパルミチン酸デルタ酸化= 1.26±1.12 (Ørngreen ら、2005 年) d2 = 0.87; (MIREDIF) 運動中のパルミチン酸酸化の増加は、二重 CPT2 遺伝子変異を持つ患者のレベルから単一の CPT2 遺伝子変異被験者のレベルまで増加します。 (Ørngreen ら、2005 年)。

(1.96 + 0.84)2 * 1.25 n ≥ _________________________ = 11 0.87

強度の計算は、CPT II 欠乏症患者の脂肪酸化に関する以前の研究に基づいています。 Ørngreen et al 2005 この研究では、健常対照者の脂肪酸化と比較して、それぞれ 2 つと 1 つの CPT2 遺伝子変異を持つ患者とキャリアの脂肪酸化について説明しました。 CPT II 患者の脂肪酸化に対するベザフィブラートの予想される効果は、CPT II 欠損症患者の脂肪酸化の平均値と、1 つの CPT2 遺伝子変異のヘテロ接合保因者の脂肪酸化の平均値との差であると予想されます。 強度計算は、11 人の被験者を含める必要があることを示しています。 目的は、CPT II 欠損症の患者群と VLCAD 欠損症の患者群のそれぞれから 11 人の患者を含めることです。 どういうわけか、それほど多くの患者を含めることができないことが判明した場合. 2 つのグループが 1 つのグループにプールされます。 これは、運動中の主要な結果の 1 つである、症状と脂肪の酸化の両方において 2 つのグループが類似しているためです。Ørngreen et al 2005, Ørngreen et al 2004少なくとも 1 治療期間、結果がデータに含まれます。 個々の治療間の違いは、対応のあるスチューデントの t 検定によって評価されます。 p 値 < 0.05 (両側検定) は有意と見なされます。

忍耐

包含基準:

1. リンパ球または線維芽細胞で測定された CPT II または VLCAD 活性の有意な減少と、CPT II 欠損症または VLCAD 欠損症のいずれかの遺伝的検証。
2. 18～65歳の男女。
3. すべての肥沃な女性は、陰性の妊娠検査を受け、研究期間中に避妊薬を使用する必要があります.

除外基準:

1. ベザフィブラートの製品履歴書に記載されている競合薬の摂取。
2. スポンサーまたは研究者によって評価された競争障害
3. -フィブラート療法期間中の妊娠または授乳

安全パラメータ:

• 治療前および治療期間中の隔週±1週間のCK。
• 肝酵素（AST、ALT、γGT、リン酸アルカリ）、ビリルビン、クレアチニン、コレステロール、トリグリセリド、治療期間前、1ヶ月±1週間、治療期間終了時。 血液サンプルは地元の病院で採取され、結果は治験依頼者または治験責任医師にファックスで送信されます。
• すべての患者は、次の場合に関係する医師の 1 人に連絡するように通知されます: 1) 病気の症状または 2) 治療の副作用.

治療期間中の患者のコンプライアンスを確保するために、次の手順に従います。

• 患者は毎週メールまたは電話で連絡を受け、治療が行われていること、および疾患の症状や治療の副作用がないことを確認します。
• 患者の 1 人が薬の処方に従うのを忘れた場合、治験依頼者または治験責任医師の評価の後、治療期間が延長されます。

薬物：

この研究では、フィブラート Bezafibrate を使用します。 効果と副作用の詳細な情報については、ベザフィブラートの製品履歴書を添付したファイルを参照してください。

ランダム化と非盲検化: すべての薬は薬局から盲検化され、ランダム化されて配送されます。 治療の生命を脅かすまたは他の容認できない副作用が発生した場合、スポンサーまたは研究者の決定後に患者の盲検を解除することができます。 無作為化リストは、デンマークの秘書マレーネ・クロンボルグ・ハブと MD ティナ・ディスガード・ジェッペセンによって保管されます。 この 2 人は 1 日 24 時間対応しており、それ以外の場合は調査に関与していません。