지방산 산화 결함 환자의 근육 대사에 대한 Bezafibrate의 효과 (Bezafibrate)

배경 및 연구 목적:

Carnitine palmitoyltransferase II(CPTII) 및 VLCAD(very-long chain acyl-CoA-dehydrogenase) 결핍은 성인의 미토콘드리아 지방산 산화(FAO)의 두 가지 가장 흔한 유전 장애이며, 둘 다 상염색체 열성 방식으로 유전됩니다. 미토콘드리아 FAO는 포도당 절약과 주요 에너지 공급이 모두 필요한 단식, 발열 또는 장기간 운동과 같은 상황에서 에너지 항상성을 유지하는 데 중추적인 역할을 합니다. 이러한 상황에서 골격근, 심장 및 간과 같은 많은 조직은 지방산을 주요 에너지원으로 선호합니다. 내인성 유리 지방산의 주요 부분을 나타내는 장쇄 지방산(LCFA)은 단순 확산에 의해 미토콘드리아 매트릭스 구획으로 들어갈 수 없으며 미토콘드리아 막을 가로지르는 LCFA의 전달은 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제(CPT)라는 다중 효소 시스템에 의해 제어됩니다. CPT I 및 II의 두 가지 효소로 구성됩니다. LCFA 산화의 주요 조절 단계인 CPT I은 외부 미토콘드리아 막 내에 위치하고 CPT II는 내부 미토콘드리아 막의 내면에 부착됩니다. CPT I 및 II는 각각 순방향 및 역방향으로 단일 반응(카르니틴 + 아실-CoA ⇔ 아실카르니틴 + CoA~SH)을 촉매합니다. VLCAD는 내부 미토콘드리아 막에 결합하고 장쇄 지방산 β-산화 나선의 첫 번째 단계를 촉매합니다(Izai et al., 1992).

CPT II 및 VLACD 결핍의 다양한 표현형이 설명되었습니다. 심각한 신생아 또는 영아 임상 생명을 위협하는 증상은 생후 첫 달 또는 몇 년 동안 저혈당 저혈당증, 간부전 및 심근병증과 함께 발생할 수 있습니다(Demaugre et al, 1991; Bonnefont et al, 1996; Vianey-Saban et al. 1998; Andresen 외, 1999). 반대로, 이러한 질병의 "성인" 형태는 더 널리 퍼져 있으며 골격근에 제한된 임상 표현을 가지고 있습니다. 후자의 형태에서 발병은 10대 또는 젊은 성인에서 가장 흔하게 발생하며 주로 장기간의 운동, 금식, 감기 또는 열에 의해 유발되는 반복적인 횡문근 융해증 에피소드가 특징입니다(DiMauro et al., 1973; Vianey-Saban et al. 1998). . 잠재적인 주요 합병증은 횡문근 융해증 발작에 따른 급성 신부전입니다.

CPT II 및 VLCAD 결핍이 있고 운동 중 안정한 동위원소가 있는 피험자의 연료 사용에 대한 연구는 장기간 저강도 운동 중에 LCFA의 생체 내 산화가 심각하게 손상되었음을 보여주었습니다. 이러한 결과는 잔류 CPT II 및 VLCAD 활동이 휴식 시 지방의 정상적인 산화를 유지하기에 충분하지만 운동 중 지방 산화 속도가 기본 수준 이상으로 증가할 수 없음을 나타냅니다(Ørngreen et al., 2004; 2005).

장쇄 FAO 장애에 대한 현재 권장되는 치료법은 기본적으로 중쇄 트리글리세리드 공급(MCT 오일)과 함께 장쇄 지방 섭취를 제한하는 식이 요법에 의존합니다. 탄수화물이 풍부한 식이요법은 CPT II 결핍 환자의 운동 내성을 향상시켰는데, 이는 이러한 식이요법 후 인지된 노력을 낮추고 운동 시간을 늘림으로써 알 수 있습니다(Ørngreen et al., 2003). 보다 최근에는 VLCAD 결핍이 있는 3명의 어린이에게서 7탄소 중쇄 지방산(트리헵타노인)으로 식이 보충제를 섭취한 후 심장 및 근육 증상이 현저하게 개선되었습니다. 이 효과의 기저에 있는 메커니즘은 C5 케톤체와 프로피오닐-CoA의 생산을 포함하는 것으로 믿어지며, 이는 구연산 순환을 위한 촉매 중간체 풀의 보충을 가능하게 합니다(Roe et al., 2002). 이 유망한 접근 방식은 아직 평가 중이며 현저한 소화 부작용으로 인해 더 심각한 형태의 FAO 결함에 대한 적응증이 제한될 수 있습니다. 약리학적 접근법은 잠재적으로 독성이 있는 장쇄 아실-CoA를 아실카르니틴으로 전환시키는 카르니틴을 제공하기 위해 주로 카르니틴 보충입니다. 그러나 FAO 결함에서 카르니틴 보충제의 역할은 논란의 여지가 있으며 통제된 실험의 부재로 인해 가치가 입증되지 않았습니다.

PPARα 수용체는 CPTII 및 VLCAD 결핍의 약물 치료를 위한 잠재적 표적으로 확인되었습니다. PPARα는 CPT2 및 VLCAD 유전자 발현을 변형시킬 수 있는 스테로이드-갑상선 호르몬 수용체의 수퍼패밀리에 속하는 전사 인자이다(Lemberger et al, 1996). Djouadiet al. 쥐를 통제하기 위해 CPT I 억제제(etomoxir)를 투여하면 중쇄 아실-CoA 탈수소효소 및 아실-CoA 산화효소 유전자와 같은 지방산 산화에 관여하는 PPARα 표적 유전자의 피드백 유도가 일어난다는 것이 확립되었습니다(Djouadi et al, 1998). PPARα는 또한 성체 마우스 심장 및 간에서 CPT2 유전자 및 단백질의 구성적 발현을 조절하고 마우스 간에서 피브레이트에 대한 반응으로 CPT2 유전자의 상향 조절을 매개하는 것으로 나타났습니다(Aoyama et al, 1998, Watanabe et al, 2000 ). 인간에서 지질저하제(clofibrate, bezafibrate, gemfibrozil 등)의 "fibrate" 부류는 PPARα의 특정 리간드이며 PPARα와의 상호작용은 이러한 약물의 치료 효과의 분자 기반을 형성합니다(Vamecq et al, 1999). Bastin J와 Djouadi F의 연구 그룹은 PPARα의 활성제 역할을 하는 고지혈증 약물인 bezafibrate가 CPT II 및 VLCAD 결핍 세포주에서 FAO를 자극할 수 있다는 가설을 세웠습니다. "성인" 형태의 질병을 앓고 있는 4명의 CPT II 결핍 환자의 섬유모세포에 대한 베자피브레이트 치료는 1) CPT2 mRNA의 양(+ 47%에서 + 66%) 및 잔류 CPT II 효소 활성(+ 54%)을 증가시키는 것으로 나타났습니다. %에서 + 135 %) 시간 및 용량 의존 방식으로, 2) 3H-팔미테이트 및 3H-미리스테이트 산화 속도를 정상화합니다. 반대로, 베자피브레이트는 CPTII 결핍의 "유아" 형태를 가진 2명의 환자에서 FAO를 교정하지 못했습니다(Djouadi et al, 2003). CPT2 결핍의 "성인" 형태의 임상적 표현은 골격근으로 제한되기 때문에 피브레이트의 효과는 이러한 환자의 근육 샘플에서 FAO에 대해 테스트되었습니다. CPTII 결핍의 "성인" 형태를 가진 환자의 근육 샘플을 제공받은 후 Myology 연구소(P. Laforêt, B. Eymard), 이러한 생검에서 얻은 근모세포는 대조군 세포에 비해 FAO가 40% 감소한 것으로 나타났습니다(Djouadi et al, 2003). 더욱이 베자피브레이트로 CPTII가 결핍된 근육모세포를 전처리하면 FAO가 정상 수준으로 회복되었습니다(Bastin et al, 2003).

최근에는 Djouadi et al. (2005)는 배양 배지에 베자피브레이트를 첨가하면 VLCAD 결핍의 근병증 형태를 가진 환자의 섬유아세포에서 팔미트산 산화 능력이 용량 의존적으로(최대 3배) 증가하지만 심하게 영향을 받은 환자에서는 그렇지 않음을 입증했습니다. 이러한 생물학적 개선은 VLCAD mRNA(+44~+150%), 단백질(1.5-2배) 및 환자 세포의 잔류 효소 활성(최대 7.7배)의 약물 유발 증가와 관련이 있습니다. 베자피브레이트는 또한 중등도의 VLCAD 결핍이 있는 세포에서 장쇄 아실 카르니틴의 생산을 90%까지 감소시켰습니다. 같은 그룹은 또한 45개의 다른 돌연변이를 나타내는 33개의 VLCAD 결핍 섬유아세포에서 유전자형의 함수로서 베자피브레이트에 대한 반응을 조사했습니다. 베자피브레이트로 치료하면 FAO 용량이 현저하게 증가하여 주로 근병증 표현형 환자에 해당하는 21개 유전자형에 대해 정상 값으로 회복되는 경우가 많습니다(Gobin-Limballe et al., 2007).

연구 영역의 상황 및 이 영역에서 연구자의 결과 위의 데이터는 인간의 FAO 결함에 대한 PPAR 작용제의 가능한 약리학적 효과에 대한 첫 번째 증거를 제공했습니다. 지난 2년 동안 Pitié-Salpêtrière와 Necker 병원이 협력하여 근육 형태의 CPT II 결핍에 대한 베자피브레이트의 잠재적 유익한 효과를 평가하는 파일럿 임상 시험이 수행되었습니다(appel d'offre AFM 2004). CPT II 결핍이 있는 6명의 성인 환자는 6개월 동안 매일 400mg의 베자피브레이트를 투여 받았습니다. 치료에 대한 임상적 내약성은 우수했으며, 근육통 강도 및 기간의 감소와 함께 5/6 환자에서 근육 증상이 호전되었습니다. 시험관 내 분석은 연구 전과 연구 종료 시 샘플링된 림프구 및 골격근에 대해 수행되었습니다. 분리된 근육 미토콘드리아의 LCFAO는 6/6 환자에서 강력하게 유도되었으며, 이 효과는 CPT2 mRNA 및 단백질 수준의 약물 유도된 상향 조절의 결과인 것으로 나타났습니다(Djouadi et al., 2007). 그러나 이 연구의 주요 평가변수는 주로 생화학적 분석이었고, 우리는 횡문근 융해증 발작의 빈도 감소나 생체 내 근육 대사의 개선을 명확하게 입증할 수 없었습니다.

우리는 CPT II 또는 VLCAD 결핍에 영향을 받는 성인 환자의 운동 중 대사에 대한 베자피브레이트의 효과를 평가할 것을 제안합니다. 이 연구는 11개월, 무작위 이중 맹검, 위약 대조 교차 시험이 될 것입니다. 시험은 프랑스의 Pitié-Salpêtrière 병원의 Institut de Myologie와 덴마크의 코펜하겐 대학교 Rigshospitalet의 Neuromuscular Research Unit의 두 센터에서 실시됩니다. 안정 동위원소 주입 후 사이클 에르고미터에 대한 운동 테스트는 아마도 생체 내 지방 산화를 평가하는 가장 신뢰할 수 있는 방법이기 때문에 이 기술은 이 연구의 두 가지 주요 결과 중 하나로 활용될 것이며 이의 잠재적 영향을 평가하는 주요 기준이 될 것입니다. 약물은 사이클 에르고미터에서 적당한 작업 부하 동안의 지방 산화 속도입니다.

베자피브레이트의 잠재적 효과를 평가하기 위한 두 가지 주요 결과는 다음과 같습니다.

• 주기 에르고미터에서 일정한 작업량으로 신체 활동을 하는 동안 생성된 지방 산화 및 심박수.

우리는 환자의 지방 산화가 1.7배 증가할 것으로 예상합니다.

이차 결과:

• 백혈구의 효소 활성
• 아실카르니틴 프로필
• 가속도계
• Borg 점수(인지된 노력)
• 미오글로빈뇨증의 에피소드 수
• 일일 근육통 점수(VAS)
• 에너지 사용 일지(Bouchards 설문지)

재료 및 방법:

피험자 이 연구는 9개월, 무작위, 이중 맹검, 위약 대조, 교차 시험이 될 것입니다. 통계 섹션의 강도 계산을 기반으로 22명의 환자, 각각 CPT II 환자 11명 및 VLCAD 결핍 환자 11명이 연구에 포함됩니다.

CPTII 및 VLCAD 결핍의 성인 형태는 매우 드문 질병입니다. CPTII 결핍이 있는 25명의 환자와 VLCAD 결핍의 근병성 형태를 가진 15명의 환자가 현재 두 그룹에서 추적되고 있습니다. 덴마크와 프랑스의 환자를 충분히 포함할 수 없는 경우 네덜란드와 스웨덴의 공동 작업자 환자를 포함할 것입니다. 모든 연구는 Rigshospitalet 및 Pitié-Salpêtrière 병원에서 수행됩니다. 정기적인 혈액 샘플만 다른 병원에 아웃소싱하지만 결과는 후원자 또는 조사자에게 직접 팩스 또는 우편으로 발송됩니다.

이 연구는 두 센터에서 수행됩니다.

1. Neuromuskulær Forskningsenhed, Rigshospitalet, 덴마크
2. Institut de Myologie, Pitié-Salpêtrière 병원, Frankrig
3. 코펜하겐 지역 약국, Alice Rosendahl, Marielundvej 25, Herlev, 덴마크
4. 코펜하겐 근육 연구 센터, Rigshospitalet, Blegdamsvej 9, København Ø, 덴마크
5. GCP 단위, Bispebjerg 병원, Bispebjerg Bakke 23, København NV, 덴마크

이 연구는 네 가지 기간으로 나뉩니다.

• 첫 번째 기간: 1개월 관찰 기간.
• 두 번째 기간: Bezafibrate 또는 위약으로 3개월 치료.
• 세 번째 기간: 2개월 워시 아웃.
• 네 번째 기간: Bezafibrate 또는 위약(두 번째 기간과 반대 약물)으로 3개월 치료.

환자는 네 기간 모두에서 근육통(VAS 점수) 및 에너지 활용도(Bouchards 설문지)의 일일 점수를 작성해야 합니다.

첫 번째 기간:

1. 무작위 배정 전에 모든 환자는 1개월의 관찰 기간을 갖습니다.
2. 크레아틴 키나아제는 치료 전 근육 손상 수준을 정의하기 위해 이 기간 동안 정기적으로 측정됩니다.
3. 실험을 위한 최대 산소 섭취량(VO2max)의 50% 작업 부하를 결정하기 위해 모든 피험자는 이 기간이 끝날 때 사이클 에르고미터에서 최대 증분 사이클 운동 테스트를 완료합니다.

두 번째 및 네 번째 기간:

1. 대상자는 실험 3일 전에 65% 탄수화물, 15% 단백질 및 20% 지방을 포함하는 표준화된 탄수화물이 풍부한 식단을 따르도록 지시받을 것입니다.
2. 지방 산화 연구: 3개월의 관찰 기간 후 피험자는 오전 9시에 실험실에서 만날 것입니다. 두 개의 카테터가 팔 정맥에 삽입됩니다. 하나는 안정적인 동위원소 주입을 위한 입방정맥에, 다른 하나는 혈액 샘플링을 위한 원위두정맥에 삽입됩니다. 피험자는 [U-13C]-팔미테이트(0.0026 mg kg-1 min-1, 0.085 mg kg-1 NaH13CO3 볼루스로 프라이밍됨, NB! 비방사성 및 비위험 추적자)의 프라이밍된 일정한 속도 주입을 받게 됩니다. . 동위원소 주입 시작 2시간 후 피험자는 탈진 또는 최대 60분 동안 순환합니다. 이전에 결정된 대로 VO2max의 50-60% 작업량에서. 심박수와 인지된 운동 수준(Borg Scale)은 운동 중 2분마다 모니터링됩니다. 동위원소 측정을 위한 혈액 및 호기 가스는 휴식 및 운동 중에 10분 간격으로 수집됩니다. 만료된 공기는 15L Douglas 백에 수집되고 백의 10ml 공기 샘플은 13CO2 농축 분석을 위해 vacutainer 튜브에 주입됩니다. 아실 카르니틴에 대한 혈액 샘플은 30분 및 60분 후에 수집됩니다. 운동 중이거나 피로할 때, 그리고 운동 후 3시간 후에. CPT II 및 VLCAD의 효소 활성은 백혈구에서 측정됩니다. 상기 기술된 테스트는 각 치료 기간 전후에 모두 실행될 것이다.
3. 환자는 두 그룹으로 무작위 배정되어 두 번째 기간에 베자피브레이트 3 x 200mg 또는 위약을 투여받거나 네 번째 기간에 그 반대가 됩니다. 환자와 모든 건강 관리 개인은 치료를 위해 눈이 멀었습니다. 무작위 추출은 코펜하겐의 GMP 인증 지역 약국에서 수행합니다.
4. 이 두 기간의 첫 시험일에 환자는 혈액 샘플을 채취하여 크레아틴 키나아제, 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 지단백질, 총 장쇄 지방산, 총 카르니틴, 아실카르니틴, 빌리루빈, 크레아티닌, 아스파르테이트 아미노 전이 효소(ASAT), 알라닌을 분석합니다. 아미노 트랜스퍼라제(ALAT), γ 글루타밀 트랜스퍼라제 및 알칼리 포스파타제.
5. 활동 수준을 표시하기 위해 환자는 각 치료 기간의 마지막 14일 동안 가속도계를 휴대합니다.

세 번째 기간:

1. 워시아웃 기간 2개월.
2. 2주마다 크레아틴 키나아제 수치 측정.

통계 분석

강도 계산:

이중 맹검, 무작위 및 교차:

(z1-α/2 + Z1-β )2 * SD2 n ≥ _________________________ d2

Z1-α/2 = 1.96; 1종 오류 위험(α=0.05) Z1-β = 0.84; 제2종 오류 위험: (1-β) = 80% SD2 = 1.25; CPT II 결핍 환자 4명의 델타 팔미테이트 산화 = 1.26±1.12 (Ørngreen et al, 2005) d2 = 0.87; (MIREDIF) 이중 CPT2 유전자 돌연변이 환자 수준에서 단일 CPT2 유전자 돌연변이 대상자 수준으로 운동 중 팔미테이트 산화 증가. (Ørngreen 등, 2005).

(1.96 + 0.84 )2 * 1.25 n ≥ _________________________ = 11 0.87

강도 계산은 CPT II 결핍 환자의 지방 산화에 대한 이전 연구를 기반으로 합니다. Ørngreen et al 2005 이 연구에서 우리는 건강한 대조군에서의 지방 산화와 비교하여 각각 2개 및 1개의 CPT2 유전자 돌연변이를 가진 환자 및 보균자의 지방 산화를 설명했습니다. CPT II 환자의 지방 산화에 대한 베자피브레이트의 예상 효과는 CPT II 결핍 환자의 지방 산화 평균값과 하나의 CPT2 유전자 돌연변이의 이형 접합 보인자에서의 지방 산화 평균값 간의 차이일 것으로 예상됩니다. 강도 계산은 11명의 대상이 포함되어야 함을 나타냅니다. 목표는 CPT II 결핍 환자 그룹과 VLCAD 결핍 환자 그룹에서 각각 11명의 환자를 포함하는 것입니다. 어쨌든 그렇게 많은 환자를 포함할 수 없다는 것이 밝혀지면. 두 그룹이 하나의 그룹으로 통합됩니다. 이는 운동 중 주요 결과 중 하나인 증상과 지방 산화 모두에서 두 그룹의 유사성 때문에 수행할 수 있습니다.Ørngreen et al 2005, Ørngreen et al 2004 데이터 누락: 환자가 완료하는 한 적어도 하나의 치료 기간, 결과는 데이터에 포함됩니다. 개인의 치료 사이의 차이는 짝을 이룬 스튜던트 t-테스트로 평가할 것입니다. p 값 < 0.05(양측 테스트)는 유의한 것으로 간주됩니다.

환자

포함 기준:

1. CPT II 결핍 또는 VLCAD 결핍에 대한 유전적 검증과 함께 림프구 또는 섬유아세포에서 측정된 CPT II 또는 VLCAD 활동의 현저한 감소.
2. 18-65세의 남녀.
3. 모든 가임 여성은 임신 테스트 결과 음성 판정을 받아야 하며 연구 기간 동안 수태 방지제를 사용해야 합니다.

제외 기준:

1. 베자피브레이트의 제품 이력서에 설명된 경쟁 약물의 섭취.
2. 후원자 또는 연구자가 평가한 경쟁 장애
3. 피브레이트 치료 기간 동안의 임신 또는 수유

안전 매개변수:

• CK 전 및 격주 ± 치료 기간 동안 1주.
• 간 효소(AST, ALT, γGT, 알칼리 인산염), 빌리루빈, 크레아티닌, 콜레스테롤, 치료 기간 전, 1개월 ± 1주 및 치료 기간 종료 시점의 트리글리세리드. 혈액 샘플은 지역 병원에서 채취되며 결과는 후원자 또는 조사자에게 팩스로 전송됩니다.
• 모든 환자는 1) 질병의 증상 또는 2) 치료의 부작용이 있는 경우 관련 의사 중 한 명에게 연락하도록 통보됩니다.

치료 기간 동안 환자의 순응도를 보장하기 위해 다음 단계를 따릅니다.

• 환자는 매주 우편이나 전화로 연락하여 치료가 잘 진행되고 질병의 증상이나 치료 부작용이 없는지 확인합니다.
• 환자 중 한 명이 약물 처방을 잊은 경우, 후원자 또는 연구자의 평가 후 치료 기간이 연장됩니다.

약제:

이 연구에서는 피브레이트 Bezafibrate를 사용합니다. 효능 및 부작용에 대한 자세한 내용은 베자피브레이트 제품이력서 첨부파일을 참고하시기 바랍니다.

무작위화 및 눈가림 해제: 모든 약물은 맹검으로 전달되며 약국에서 무작위화됩니다. 생명을 위협하거나 용인할 수 없는 기타 치료 부작용이 발생하는 경우, 환자는 후원자 또는 조사자의 결정 후 눈가림을 해제할 수 있습니다. 무작위 목록은 덴마크의 Malene Kronborg Have 장관과 MD Tina Dysgaard Jeppesen이 보관합니다. 이 두 사람은 하루 24시간 대기하며 그 외에는 연구에 참여하지 않습니다.