Effect van bezafibraat op het spiermetabolisme bij patiënten met vetzuuroxidatiedefecten (Bezafibrate)

Achtergrond en onderzoeksdoel:

Carnitine palmitoyltransferase II (CPTII) en zeer lange keten acyl-CoA-dehydrogenase (VLCAD) deficiënties zijn de twee meest voorkomende erfelijke aandoeningen van mitochondriale vetzuuroxidatie (FAO) bij volwassenen, beide overgeërfd op een autosomaal recessieve manier. Mitochondriale FAO speelt een cruciale rol bij het handhaven van de energiehomeostase in situaties zoals vasten, koorts of langdurige inspanning die zowel glucosesparen als een grote energievoorziening vereisen. In deze situaties geven een aantal weefsels, zoals de skeletspieren, het hart en de lever, de voorkeur aan vetzuren als de belangrijkste energiebron. Langketenige vetzuren (LCFA), die het grootste deel van de endogene vrije vetzuren vertegenwoordigen, kunnen het mitochondriale matrixcompartiment niet binnendringen door eenvoudige diffusie, en de overdracht van LCFA over de mitochondriale membranen wordt geregeld door een multi-enzymatisch systeem genaamd carnitine palmitoyltransferase (CPT) bestaande uit twee enzymen: CPT I en II. CPT I, een belangrijke regulerende stap van LCFA-oxidatie, bevindt zich in het buitenste mitochondriale membraan, terwijl CPT II is bevestigd aan de binnenkant van het binnenste mitochondriale membraan. CPT's I en II katalyseren een enkele reactie (carnitine + acyl-CoA ⇔ acylcarnitine + CoA~SH) in respectievelijk voorwaartse en achterwaartse richting. VLCAD is gebonden aan het binnenste mitochondriale membraan en katalyseert de eerste stap van de β-oxidatiespiraal met lange vetzuurketens (Izai et al., 1992).

Er zijn verschillende fenotypes van CPT II- en VLACD-deficiënties beschreven. Ernstige neonatale of infantiele klinische levensbedreigende symptomen kunnen optreden met hypoketotische hypoglykemie, leverfalen en cardiomyopathie gedurende de eerste maanden of jaren van het leven (Demaugre et al, 1991; Bonnefont et al, 1996; Vianey-Saban et al. 1998; Andresen e.a., 1999). Omgekeerd komen de "volwassen" vormen van deze ziekten meer voor en hebben een klinische uitdrukking die beperkt is tot de skeletspieren. Bij de laatste vorm treedt de aanvang het vaakst op bij tieners of jongvolwassenen en wordt voornamelijk gekenmerkt door terugkerende episoden van rabdomyolyse veroorzaakt door langdurige inspanning, vasten, verkoudheid of koorts (DiMauro et al., 1973; Vianey-Saban et al. 1998). . De belangrijkste mogelijke complicatie is acuut nierfalen na aanvallen van rabdomyolyse.

Studies naar brandstofgebruik bij proefpersonen met CPT II- en VLCAD-deficiënties, met stabiele isotopen tijdens inspanning, hebben aangetoond dat in vivo oxidatie van LCFA ernstig werd aangetast tijdens langdurige, lage intensiteitsoefeningen. Deze bevindingen gaven aan dat resterende CPT II- en VLCAD-activiteiten voldoende zijn om de normale vetoxidatie in rust te behouden, maar dat de vetoxidatiesnelheid tijdens inspanning niet boven het basale niveau kan stijgen (Ørngreen et al., 2004; 2005).

De huidige aanbevolen behandelingen voor FAO-aandoeningen met lange ketens berusten in wezen op dieetbenaderingen, met beperking van de inname van vet met lange ketens samen met middellange keten triglyceriden (MCT-olie). Een koolhydraatrijk dieet verbeterde ook de inspanningstolerantie bij patiënten met CPT II-deficiëntie, zoals blijkt uit een vermindering van de waargenomen inspanning en een langere duur van de inspanning na een dergelijk dieet (Ørngreen et al., 2003). Meer recentelijk trad een opmerkelijke verbetering op van hart- en spiersymptomen bij drie kinderen met VLCAD-deficiëntie, na voedingssuppletie met een middellange-ketenvetzuur met zeven koolstofatomen (triheptanoïn). Aangenomen wordt dat het mechanisme dat aan dit effect ten grondslag ligt, de productie van C5-ketonlichamen en propionyl-CoA inhoudt, waardoor de pool van katalytische tussenproducten voor de citroenzuurcyclus kan worden aangevuld (Roe et al., 2002). Deze veelbelovende aanpak wordt nog steeds geëvalueerd en uitgesproken bijwerkingen op de spijsvertering zouden de indicatie ervan kunnen beperken tot de meer ernstige vorm van FAO-defecten. Farmacologische benaderingen zijn voornamelijk carnitine-suppletie om carnitine te verschaffen om potentieel toxische langketenige acyl-CoA's om te zetten in acylcarnitines. De rol van carnitinesupplementen bij FAO-defecten blijft echter controversieel en van onbewezen waarde vanwege het ontbreken van gecontroleerde onderzoeken.

PPARα-receptoren werden geïdentificeerd als potentiële doelwitten voor farmacologische therapie van CPTII- en VLCAD-deficiënties. PPARα is een transcriptiefactor, behorend tot de superfamilie van steroïde-schildklierhormoonreceptoren, die de genexpressie van CPT2 en VLCAD kan wijzigen (Lemberger et al, 1996). Djouadi et al. stelde vast dat toediening aan controlemuizen van een CPT I-remmer (etomoxir) een feedback-inductie veroorzaakt van PPARa-doelgenen die betrokken zijn bij vetzuuroxidatie, zoals acyl-CoA-dehydrogenase- en acyl-CoA-oxidasegenen met gemiddelde keten (Djouadi et al, 1998). PPARα bleek ook de constitutieve expressie van het CPT2-gen en -eiwit in het hart en de lever van volwassen muizen te reguleren en opwaartse regulatie van het CPT2-gen te bemiddelen als reactie op fibraten in muizenlever (Aoyama et al, 1998, Watanabe et al, 2000 ). Bij mensen zijn de "fibraat"-klasse van hypolipidemische geneesmiddelen (clofibraat, bezafibraat, gemfibrozil, enz…) specifieke liganden van PPARα en de interactie met PPARα vormt de moleculaire basis van de therapeutische effecten van deze geneesmiddelen (Vamecq et al, 1999). De onderzoeksgroep van Bastin J en Djouadi F veronderstelde dat het hypolipidemische medicijn bezafibraat, dat werkt als een activator van PPARα, FAO zou kunnen stimuleren in CPT II- en VLCAD-deficiënte cellijnen. Behandeling met bezafibraat van fibroblasten van vier CPT II-deficiënte patiënten met de "volwassen" vorm van de ziekte bleek 1) de hoeveelheid CPT2-mRNA (+ 47 % tot + 66 %) en de resterende CPT II-enzymactiviteit (+ 54 %) te verhogen. % tot +135%) op een tijd- en dosisafhankelijke manier, en 2) om de oxidatiesnelheden van 3H-palmitaat en 3H-myristaat te normaliseren. Omgekeerd corrigeerde bezafibraat de FAO niet bij twee patiënten met de "infantiele" vorm van CPTII-deficiëntie (Djouadi et al, 2003). Aangezien de klinische expressie van de "volwassen" vorm van CPT2-deficiëntie beperkt is tot skeletspieren, werd het effect van fibraten getest op FAO in spiermonsters van dergelijke patiënten. Na te zijn voorzien van spiermonsters van patiënten met de "volwassen" vorm van CPTII-deficiëntie, gevolgd door het Institute of Myology (P. Laforêt, B. Eymard), is aangetoond dat myoblasten uit deze biopsieën een afname van 40% in FAO vertoonden in vergelijking met controlecellen (Djouadi et al, 2003). Bovendien herstelde de voorbehandeling van CPTII-deficiënte myoblasten met bezafibraat de FAO tot normale niveaus (Bastin et al, 2003).

Meer recentelijk hebben Djouadi et al. (2005) toonden aan dat toevoeging van bezafibraat aan het kweekmedium een ​​dosisafhankelijke (tot 3-voudige) toename van de palmitaatoxidatiecapaciteit in fibroblasten induceerde van patiënten met de myopathische vorm van VLCAD-deficiëntie, maar niet van ernstig getroffen patiënten. Deze biologische verbetering was gerelateerd aan door geneesmiddelen geïnduceerde toenames in VLCAD-mRNA (+ 44 tot + 150%), eiwit (1,5-2-voudig) en residuele enzymactiviteit (tot 7,7-voudig) in cellen van de patiënten. Bezafibraat verminderde ook de productie van acyl-carnitines met lange ketens met 90% in cellen met matige VLCAD-deficiëntie. Dezelfde groep onderzocht ook de respons op bezafibraat als functie van het genotype in 33 VLCAD-deficiënte fibroblasten die 45 verschillende mutaties vertegenwoordigen. Behandeling met bezafibraat resulteerde in een duidelijke toename van de FAO-capaciteiten, vaak leidend tot herstel van normale waarden, voor 21 genotypen die voornamelijk overeenkomen met patiënten met het myopathische fenotype (Gobin-Limballe et al., 2007).

Situatie van het onderzoeksgebied en resultaten van de onderzoeker op dit gebied Bovenstaande gegevens leverden het eerste bewijs voor een mogelijk farmacologisch effect van PPAR-agonisten op FAO-defecten bij mensen. In de afgelopen twee jaar is in samenwerking met de ziekenhuizen Pitié-Salpêtrière en Necker een klinische pilotstudie uitgevoerd waarin de mogelijke gunstige effecten van bezafibraat op de spiervorm van CPT II-deficiëntie worden beoordeeld (appel d'offre AFM 2004). Zes volwassen patiënten met CPT II-deficiëntie kregen gedurende 6 maanden dagelijks een dosis van 400 mg bezafibraat. De klinische tolerantie van de behandeling was uitstekend en de spiersymptomen verbeterden bij 5/6 patiënten met een afname van de myalgie-intensiteit en -duur. In vitro analyses werden uitgevoerd op lymfocyten en skeletspieren, bemonsterd voorafgaand aan en aan het einde van het onderzoek. LCFAO in geïsoleerde spiermitochondriën werd sterk geïnduceerd bij 6/6 patiënten, en dit effect bleek het gevolg te zijn van door geneesmiddelen geïnduceerde opwaartse regulatie van CPT2-mRNA en eiwitniveaus (Djouadi et al., 2007). De belangrijkste eindpunten van deze studie waren echter voornamelijk biochemische analyse, en we konden geen duidelijke afname van de frequentie van rabdomyolyse-aanvallen aantonen, noch een verbetering van het in vivo spiermetabolisme.

We stellen voor om het effect van bezafibraat op het metabolisme tijdens inspanning te evalueren bij volwassen patiënten met CPT II- of VLCAD-deficiënties. Deze studie zal een 11 maanden durende, gerandomiseerde, dubbelblinde, placebo-gecontroleerde cross-over studie zijn. De proef zal worden uitgevoerd in twee centra: Institut de Myologie, Pitié-Salpêtrière Hospital in Frankrijk en Neuromuscular Research Unit, Rigshospitalet, Universiteit van Kopenhagen, in Denemarken. Aangezien een inspanningstest op een fietsergometer na infusie van stabiele isotopen waarschijnlijk de meest betrouwbare manier is om in vivo vetoxidatie te beoordelen, zal deze techniek worden gebruikt als een van de twee belangrijkste resultaten voor deze studie, en de belangrijkste criteria voor het beoordelen van het potentiële effect hiervan. medicijn zal de vetoxidatiesnelheid zijn tijdens een matige belasting op de fietsergometer.

De twee belangrijkste uitkomsten om het potentiële effect van Bezafibraat te beoordelen zijn:

• Vetverbranding en hartslag gegenereerd tijdens fysieke activiteit op de fietsergometer bij een constante belasting.

We verwachten dat de vetverbranding bij de patiënten met een factor 1,7 zal toenemen.

Secundaire uitkomsten:

• Enzymactiviteit in leukocyten
• Acylcarnitine-profiel
• Versnellingsmeter
• Borgscore (waargenomen inspanning)
• Aantal afleveringen van myoglobinurie
• Dagelijkse spierpijnscore (VAS)
• Dagelijks dagboek van energieverbruik (Bouchards-vragenlijst)

Materiaal en methoden:

Onderwerpen Deze studie zal een 9 maanden durende, gerandomiseerde, dubbelblinde, placebo-gecontroleerde, cross-over studie zijn. Op basis van de berekening van de sterkte in het deel van de statistiek zullen 22 patiënten, respectievelijk 11 patiënten met CPT II en 11 patiënten met VLCAD-deficiëntie, in het onderzoek worden opgenomen:

De volwassen vormen van CPTII- en VLCAD-deficiënties zijn zeer zeldzame ziekten. Vijfentwintig patiënten met CPTII-deficiëntie en 15 patiënten met de myopathische vorm van VLCAD-deficiëntie worden momenteel gevolgd in onze twee groepen. In het geval dat we niet genoeg patiënten uit Denemarken en Frankrijk kunnen opnemen, zullen we patiënten van onze medewerkers in Nederland en Zweden opnemen. Alle onderzoeken zullen worden uitgevoerd in het Rigshospitalet en het Pitié-Salpêtrière-ziekenhuis. Alleen de regelmatige bloedmonsters worden uitbesteed aan andere ziekenhuizen, maar de resultaten worden rechtstreeks naar de sponsor of onderzoekers gefaxt of gemaild.

De studie zal worden uitgevoerd op de twee centra:

1. Neuromuskulær Forskningsenhed, Rigshospitalet, Denemarken
2. Institut de Myologie, Pitié-Salpêtrière Ziekenhuis, Frankrig In samenwerking met
3. Copenhagen Region Pharmacy, Alice Rosendahl, Marielundvej 25, Herlev, Denemarken
4. Copenhagen Muscle Research Center, Rigshospitalet, Blegdamsvej 9, København Ø, Denemarken
5. GCP-unit, Bispebjerg hospital, Bispebjerg Bakke 23, København NV, Denemarken

De studie is verdeeld in vier periodes:

• Eerste periode: observatieperiode van 1 maand.
• Tweede periode: 3 maanden behandeling met Bezafibrate of placebo.
• Derde periode: 2 maanden uitwassen.
• Vierde periode: 3 maanden behandeling met Bezafibrate of placebo (het tegenovergestelde geneesmiddel als in de tweede periode).

Patiënten moeten gedurende alle vier de perioden dagelijkse scores van spierpijn (VAS-score) en energieverbruik (Bouchards-vragenlijst) invullen.

Eerste periode:

1. Voorafgaand aan de randomisatie hebben alle patiënten een observatieperiode van 1 maand.
2. Creatinekinase zal in deze periode regelmatig worden gemeten om het niveau van spierbeschadiging vóór de behandeling te bepalen.
3. Om een ​​belasting van 50% van de maximale zuurstofopname (VO2max) voor het experiment te bepalen, zullen alle proefpersonen aan het einde van deze periode een maximale incrementele fietsinspanningstest afleggen op een fietsergometer.

Tweede en vierde periode:

1. De proefpersonen zullen worden geïnstrueerd om drie dagen voorafgaand aan het experiment een gestandaardiseerd koolhydraatrijk dieet te volgen dat 65% koolhydraten, 15% eiwit en 20% vet bevat.
2. Onderzoek naar vetoxidatie: Na de observatieperiode van 3 maanden ontmoeten de proefpersonen elkaar om 9.00 uur in het lab. Er zullen twee katheters in de armaders worden ingebracht, één in de cubitale ader voor stabiele isotoopinfusie en één in de distale cephalische ader voor bloedafname. De proefpersonen krijgen een geprimed infuus met constante snelheid van [U-13C]-palmitaat (0,0026 mg kg-1 min-1, geprimed door een bolus van 0,085 mg kg-1 NaH13CO3, NB! niet-radioactieve en niet-gevaarlijke tracers) . Twee uur na het begin van de isotopeninfusie fietsen de proefpersonen tot uitputting of gedurende maximaal 60 minuten. bij een belasting van 50-60% van VO2max zoals eerder bepaald. De hartslag en het niveau van de waargenomen inspanning (Borg-schaal) worden tijdens de training om de minuut gecontroleerd. Bloed en uitgeademde gassen voor isotopenmetingen worden verzameld met tussenpozen van 10 minuten in rust en tijdens inspanning. De uitgeademde lucht wordt opgevangen in een Douglas-zak van 15 liter en 10 ml luchtmonsters uit de zakken worden in vacutainerbuizen geïnjecteerd voor analyse van de 13CO2-verrijking. Bloedmonsters voor acylcarnitines worden na 30 en 60 minuten afgenomen. inspanning of bij uitputting, en drie uur na inspanning. De enzymactiviteit van CPT II en VLCAD zal worden gemeten op leukocyten. De hierboven beschreven test zal zowel voor als na elke behandelperiode worden uitgevoerd.
3. Patiënten worden gerandomiseerd in twee groepen, om ofwel 3 x 200 mg bezafibraat of placebo te krijgen in de tweede periode en vice versa in de vierde periode. Patiënten en alle zorgverleners zijn geblindeerd voor de behandeling. De randomisatie wordt uitgevoerd door de GMP-gecertificeerde regionale apotheek van Kopenhagen.
4. Op de eerste proefdag van deze twee periodes zullen patiënten bloedmonsters laten nemen om creatinekinase, cholestrol, triglyceriden, lipoproteïnen, totale vetzuren met lange ketens, totale carnitine, acylcarnitines, bilirubine, creatinine, aspartaataminotransferase (ASAT), alanine te analyseren aminotransferase (ALAT), γ-glutamyltransferase en alkalisch fosfatase.
5. Om hun activiteitenniveau aan te geven, dragen de patiënten de laatste veertien dagen van elke behandelingsperiode een versnellingsmeter.

Derde periode:

1. Twee maanden uitwasperiode.
2. Metingen van creatinekinasespiegels om de twee weken.

statistische analyse

Sterkte berekening:

Dubbelblind, gerandomiseerd en crossover:

(z1-α/2 + Z1-β )2 * SD2 n ≥ _________________________ d2

Z1-a/2 = 1,96; Risico op type 1-fout (α=0,05) Z1-β = 0,84; Risico op type 2 fout: (1-β) = 80% SD2 = 1,25; deltapalmitaatoxidatie bij vier patiënten met CPT II-deficiëntie = 1,26 ± 1,12 (Ørngreen et al, 2005) d2 = 0,87; (MIREDIF) toename van palmitaatoxidatie tijdens inspanning van het niveau van de patiënten met dubbele CPT2-genmutaties tot het niveau van de enkelvoudige CPT2-genmutatieproefpersonen. (Ørngreen et al, 2005).

(1,96 + 0,84 )2 * 1,25 n ≥ _________________________ = 11 0,87

De sterkteberekening is gebaseerd op een eerder onderzoek naar vetoxidatie bij patiënten met CPT II-deficiëntie. Ørngreen et al 2005 In deze studie beschreven we de vetoxidatie van patiënten en dragers met respectievelijk twee en één CPT2-genmutatie vergeleken met de vetoxidatie bij gezonde controles. Het verwachte effect van bezafibraat op de vetoxidatie bij CPT II-patiënten is naar verwachting het verschil tussen de gemiddelde waarde van vetoxidatie bij patiënten met CPT II-deficiëntie en de gemiddelde waarde van vetoxidatie bij heterozygote dragers van één CPT2-genmutatie. De sterkteberekening geeft aan dat er een aantal van 11 proefpersonen meegenomen moeten worden. Het doel is om 11 patiënten te includeren uit respectievelijk de groepen patiënten met CPT II-deficiëntie en de groepen patiënten met VLCAD-deficiëntie. Als op de een of andere manier blijkt dat we niet zoveel patiënten kunnen opnemen. De twee groepen worden samengevoegd tot één groep. Dit kan worden gedaan vanwege de gelijkenis van de twee groepen, zowel wat betreft symptomen als wat betreft vetverbranding, wat een van de belangrijkste uitkomsten is, tijdens inspanning.Ørngreen et al 2005, Ørngreen et al 2004 Ontbrekende gegevens: zolang een patiënt de tenminste één behandelperiode, resultaten worden meegenomen in de data. Verschillen tussen behandelingen bij het individu worden beoordeeld door middel van een gepaarde Student's t-test. Een p-waarde < 0,05 (tweezijdige toetsing) wordt als significant beschouwd.

Patiënten

Inclusiecriteria:

1. Aanzienlijke afname van de CPT II- of VLCAD-activiteiten gemeten in lymfocyten of fibroblasten, samen met genetische verificatie van CPT II-deficiëntie of VLCAD-deficiëntie.
2. Mannen en vrouwen van 18-65 jaar.
3. Alle vruchtbare vrouwtjes moeten een negatieve zwangerschapstest ondergaan en anticonceptiva gebruiken tijdens de onderzoeksperiode.

Uitsluitingscriteria:

1. Inname van competitieve geneesmiddelen, zoals beschreven in de samenvatting van het product van bezafibraat.
2. Competitieve stoornissen, beoordeeld door de sponsor of onderzoekers
3. Zwangerschap of borstvoeding tijdens de periode van fibraattherapie

Veiligheidsparameters:

• CK voor en om de week ± één week tijdens de behandelingsperiode.
• Leverenzymen (AST, ALT, γGT, alkalisch fosfaat), bilirubine, creatinine, cholesterol, triglyceriden vóór de behandelingsperiode, na 1 maand ± een week en aan het einde van de behandelingsperiode. Er zullen bloedmonsters worden genomen in lokale ziekenhuizen en de resultaten zullen worden gefaxt naar sponsor of onderzoekers.
• Alle patiënten zullen worden geïnformeerd om contact op te nemen met een van de betrokken artsen in geval van: 1) symptomen van hun ziekte of 2) bijwerkingen van de behandeling.

De volgende stappen worden gevolgd om de therapietrouw van de patiënten tijdens de behandelingsperioden te waarborgen.

• Patiënten worden wekelijks per mail of telefoon gecontacteerd om er zeker van te zijn dat de behandeling wordt gevolgd en dat er geen symptomen van de ziekte of bijwerkingen van de behandeling zijn.
• Als een van de patiënten vergeet het voorschrift van de medicijnen op te volgen, wordt de behandelingsperiode verlengd na evaluatie van de sponsor of onderzoekers.

Verdovende middelen:

In deze studie gebruiken we het fibraat Bezafibraat. Voor gedetailleerde informatie over het effect en de bijwerkingen, zie het bijgevoegde bestand met het productoverzicht van Bezafibrate.

Randomiseren en deblinderen: Alle medicijnen worden geblindeerd en gerandomiseerd afgeleverd vanuit de apotheek. Bij het optreden van levensbedreigende of andere onaanvaardbare bijwerkingen van de behandeling kan de blindering van een patiënt worden opgeheven na een beslissing van de sponsor of onderzoeker. De randomisatielijst wordt bijgehouden door secretaris Malene Kronborg Have en MD Tina Dysgaard Jeppesen in Denemarken. Deze twee personen zijn 24 uur per dag beschikbaar en zijn verder niet bij het onderzoek betrokken.