Efeito do Bezafibrato no Metabolismo Muscular em Pacientes com Defeitos de Oxidação de Ácidos Graxos (Bezafibrate)

Antecedentes e objetivo da pesquisa:

As deficiências de carnitina palmitoiltransferase II (CPTII) e acil-CoA-desidrogenase de cadeia muito longa (VLCAD) são os dois distúrbios hereditários mais comuns da oxidação mitocondrial de ácidos graxos (FAO) em adultos, ambos herdados de maneira autossômica recessiva. A FAO mitocondrial desempenha um papel fundamental na manutenção da homeostase energética em situações como jejum, febre ou exercícios prolongados que requerem tanto a economia de glicose quanto o maior suprimento de energia. Nessas situações, vários tecidos, como músculo esquelético, coração e fígado, favorecem os ácidos graxos como principal fonte de energia. Os ácidos graxos de cadeia longa (LCFA), que representam a maior parte dos ácidos graxos livres endógenos, não podem entrar no compartimento da matriz mitocondrial por difusão simples, e a transferência de LCFA através das membranas mitocondriais é governada por um sistema multienzimático denominado carnitina palmitoiltransferase (CPT). composto por duas enzimas: CPT I e II. O CPT I, uma etapa regulatória chave da oxidação de LCFA, está localizado dentro da membrana mitocondrial externa, enquanto o CPT II está anexado à face interna da membrana mitocondrial interna. Os CPTs I e II catalisam uma única reação (carnitina + acil-CoA ⇔ acilcarnitina + CoA~SH) nas direções direta e reversa, respectivamente. O VLCAD está ligado à membrana mitocondrial interna e catalisa a primeira etapa da espiral de β-oxidação de ácidos graxos de cadeia longa (Izai et al., 1992).

Vários fenótipos de deficiências de CPT II e VLACD foram descritos. Sintomas clínicos neonatais ou infantis graves que ameaçam a vida podem ocorrer com hipoglicemia hipocetótica, insuficiência hepática e cardiomiopatia durante os primeiros meses ou anos de vida (Demaugre et al, 1991; Bonnefont et al, 1996; Vianey-Saban et al. 1998; Andresen e outros, 1999). Por outro lado, as formas "adultas" dessas doenças são mais prevalentes e têm expressão clínica restrita ao músculo esquelético. Na última forma, o início ocorre com mais frequência em adolescentes ou adultos jovens e é caracterizado principalmente por episódios recorrentes de rabdomiólise desencadeados por exercícios prolongados, jejum, resfriado ou febre (DiMauro et al., 1973; Vianey-Saban et al. 1998) . A principal complicação potencial é a insuficiência renal aguda após ataques de rabdomiólise.

Estudos de utilização de combustível em indivíduos com deficiências de CPT II e VLCAD, com isótopos estáveis ​​durante o exercício, mostraram que a oxidação in vivo de LCFA foi severamente prejudicada durante exercícios prolongados de baixa intensidade. Esses achados indicaram que as atividades residuais de CPT II e VLCAD são suficientes para manter a oxidação normal da gordura em repouso, mas que a taxa de oxidação da gordura não pode aumentar acima do nível basal durante o exercício (Ørngreen et al., 2004; 2005).

Os tratamentos atualmente recomendados para distúrbios da FAO de cadeia longa baseiam-se essencialmente em abordagens dietéticas, com restrição da ingestão de gordura de cadeia longa juntamente com o fornecimento de triglicerídeos de cadeia média (óleo MCT). Uma dieta rica em carboidratos também melhorou a tolerância ao exercício em pacientes com deficiência de CPT II, ​​conforme indicado pela diminuição da percepção de esforço e aumento da duração do exercício após tal dieta (Ørngreen et al., 2003). Mais recentemente, uma melhora notável dos sintomas cardíacos e musculares ocorreu em três crianças com deficiência de VLCAD, após suplementação dietética com um ácido graxo de cadeia média de sete carbonos (triheptanoína). Acredita-se que o mecanismo subjacente a esse efeito envolva a produção de corpos cetônicos C5 e propionil-CoA, o que permite a reposição do pool de intermediários catalíticos para o ciclo do ácido cítrico (Roe et al., 2002). Esta abordagem promissora ainda está sob avaliação e efeitos colaterais digestivos marcantes podem restringir sua indicação para a forma mais grave de defeitos da FAO. As abordagens farmacológicas são principalmente a suplementação de carnitina, a fim de fornecer carnitina para converter acil-CoAs de cadeia longa potencialmente tóxica em acilcarnitinas. No entanto, o papel dos suplementos de carnitina nos defeitos da FAO permanece controverso e sem valor comprovado devido à ausência de estudos controlados.

Os receptores PPARα foram identificados como alvos potenciais para a terapia farmacológica das deficiências de CPTII e VLCAD. O PPARα é um fator de transcrição, pertencente à superfamília dos receptores do hormônio esteroide-tireoide, capaz de modificar a expressão gênica de CPT2 e VLCAD (Lemberger et al, 1996). Djouadi et ai. estabeleceram que a administração a camundongos de controle de um inibidor de CPT I (etomoxir) causa uma indução de retroalimentação de genes-alvo PPARα envolvidos na oxidação de ácidos graxos, como genes de acil-CoA desidrogenase de cadeia média e acil-CoA oxidase (Djouadi et al, 1998). PPARα também demonstrou regular a expressão constitutiva do gene CPT2 e da proteína no coração e fígado de camundongos adultos e mediar a regulação positiva do gene CPT2 em resposta a fibratos no fígado de camundongos (Aoyama et al, 1998, Watanabe et al, 2000 ). Em humanos, a classe "fibrato" de drogas hipolipidêmicas (clofibrato, bezafibrato, gemfibrozil, etc.) são ligantes específicos do PPARα e a interação com o PPARα forma a base molecular dos efeitos terapêuticos dessas drogas (Vamecq et al, 1999). O grupo de pesquisa de Bastin J e Djouadi F levantou a hipótese de que o fármaco hipolipidêmico bezafibrato, agindo como um ativador de PPARα, pode estimular a FAO em linhas celulares deficientes em CPT II e VLCAD. O tratamento com bezafibrato de fibroblastos de quatro pacientes com deficiência de CPT II com a forma "adulta" da doença demonstrou 1) aumentar a quantidade de mRNA de CPT2 (+ 47 % a + 66 %) e a atividade residual da enzima CPT II (+ 54 % a + 135%) de uma maneira dependente do tempo e da dose, e 2) para normalizar as taxas de oxidação de 3H-palmitato e 3H-miristato. Por outro lado, o bezafibrato não corrigiu a FAO em dois pacientes com a forma "infantil" de deficiência de CPTII (Djouadi et al, 2003). Uma vez que a expressão clínica da forma "adulta" da deficiência de CPT2 é restrita ao músculo esquelético, o efeito dos fibratos foi testado na FAO em amostras musculares desses pacientes. Depois de receber amostras musculares de pacientes com a forma "adulta" da deficiência de CPTII acompanhados no Instituto de Miologia (P. Laforêt, B. Eymard), foi demonstrado que os mioblastos dessas biópsias exibiram uma diminuição de 40% na FAO em comparação com as células de controle (Djouadi et al, 2003). Além disso, o pré-tratamento de mioblastos deficientes em CPTII com bezafibrato restaurou a FAO aos níveis normais (Bastin et al, 2003).

Mais recentemente, Djouadi et al. (2005) demonstraram que a adição de bezafibrato no meio de cultura induziu um aumento dependente da dose (até 3 vezes) na capacidade de oxidação do palmitato em fibroblastos de pacientes com a forma miopática da deficiência de VLCAD, mas não de pacientes gravemente afetados. Essa melhora biológica foi relacionada a aumentos induzidos por drogas no mRNA de VLCAD (+ 44 a + 150%), proteína (1,5-2 vezes) e atividade enzimática residual (até 7,7 vezes) nas células dos pacientes. O bezafibrato também diminuiu a produção de acil-carnitinas de cadeia longa em 90% em células com deficiência moderada de VLCAD. O mesmo grupo também investigou a resposta ao bezafibrato em função do genótipo em 33 fibroblastos deficientes em VLCAD representando 45 mutações diferentes. O tratamento com bezafibrato resultou em um aumento acentuado nas capacidades FAO, muitas vezes levando à restauração dos valores normais, para 21 genótipos que correspondem principalmente a pacientes com o fenótipo miopático (Gobin-Limballe et al., 2007).

Situação da área de pesquisa e resultados do investigador nesta área Os dados acima forneceram a primeira evidência de um possível efeito farmacológico dos agonistas do PPAR nos defeitos da FAO em humanos. Nos últimos dois anos, um ensaio clínico piloto avaliando os potenciais efeitos benéficos do bezafibrato na forma muscular da deficiência de CPT II foi realizado em colaboração entre os hospitais Pitié-Salpêtrière e Necker (appel d'offre AFM 2004). Seis pacientes adultos com deficiência de CPT II receberam uma dose diária de 400 mg de bezafibrato durante 6 meses. A tolerância clínica ao tratamento foi excelente e os sintomas musculares melhoraram em 5/6 pacientes com diminuição da intensidade e duração da mialgia. Análises in vitro foram realizadas em linfócitos e músculo esquelético, amostrados antes e no final do estudo. O LCFAO em mitocôndrias musculares isoladas foi fortemente induzido em 6/6 pacientes, e esse efeito foi demonstrado como resultado da regulação positiva induzida por drogas de mRNA de CPT2 e níveis de proteína (Djouadi et al., 2007). No entanto, os principais objetivos deste estudo foram principalmente análises bioquímicas, e não fomos capazes de demonstrar claramente uma diminuição na frequência de ataques de rabdomiólise, nem uma melhora do metabolismo muscular in vivo.

Propomos avaliar o efeito do bezafibrato no metabolismo durante o exercício em pacientes adultos afetados com deficiências de CPT II ou VLCAD. Este estudo será um estudo cruzado randomizado, duplo-cego, controlado por placebo, de 11 meses. O ensaio será conduzido em dois centros: Institut de Myologie, Pitié-Salpêtrière Hospital na França e Neuromuscular Research Unit, Rigshospitalet, University of Copenhagen, na Dinamarca. Uma vez que o teste de exercício em cicloergômetro após a infusão de isótopos estáveis ​​é provavelmente a maneira mais confiável de avaliar a oxidação de gordura in vivo, esta técnica será utilizada como um dos dois principais resultados para este estudo, e o principal critério para avaliar o efeito potencial deste droga será a taxa de oxidação de gordura durante uma carga de trabalho moderada em cicloergômetro.

Os dois resultados principais para avaliar o efeito potencial do bezafibrato são:

• Oxidação de gordura e frequência cardíaca gerada durante atividade física em cicloergômetro em carga constante.

Esperamos que a oxidação de gordura nos pacientes aumente em um fator de 1,7.

Resultados secundários:

• Atividade enzimática em leucócitos
• Perfil de acilcarnitina
• Acelerômetro
• Pontuação de Borg (esforço percebido)
• Número de episódios de mioglobinúria
• Pontuação diária de dor muscular (EVA)
• Diário diário de utilização de energia (questionário de Bouchards)

Material e métodos:

Indivíduos Este estudo será um estudo cruzado de 9 meses, randomizado, duplo-cego, controlado por placebo. Com base no cálculo de força na seção de estatísticas, 22 pacientes, respectivamente 11 pacientes com CPT II e 11 pacientes com deficiência de VLCAD serão incluídos no estudo:

As formas adultas de deficiências de CPTII e VLCAD são doenças muito raras. Vinte e cinco pacientes com deficiência de CPTII e 15 pacientes com a forma miopática da deficiência de VLCAD são atualmente acompanhados em nossos dois grupos. Caso não possamos incluir pacientes suficientes da Dinamarca e da França, incluiremos pacientes de nossos colaboradores da Holanda e da Suécia. Todos os estudos serão conduzidos no Rigshospitalet e Pitié-Salpêtrière Hospital. Apenas as amostras de sangue regulares serão terceirizadas para outros hospitais, mas os resultados serão enviados por fax ou correio diretamente ao patrocinador ou aos investigadores.

O estudo será realizado nos dois centros:

1. Neuromuskulær Forskningsenhed, Rigshospitalet, Dinamarca
2. Institut de Myologie, Hospital Pitié-Salpêtrière, Frankrig Em colaboração com
3. Copenhagen Region Pharmacy, Alice Rosendahl, Marielundvej 25, Herlev, Dinamarca
4. Copenhagen Muscle Research Center, Rigshospitalet, Blegdamsvej 9, København Ø, Dinamarca
5. Unidade GCP, hospital Bispebjerg, Bispebjerg Bakke 23, København NV, Dinamarca

O estudo é dividido em quatro períodos:

• Primeiro período: período de observação de 1 mês.
• Segundo período: 3 meses de tratamento com Bezafibrato ou placebo.
• Terceiro período: 2 meses de lavagem.
• Quarto período: 3 meses de tratamento com Bezafibrato ou placebo (o medicamento oposto ao do segundo período).

Os pacientes devem preencher escores diários de dor muscular (pontuação VAS) e utilização de energia (questionário de Bouchards) durante todos os quatro períodos.

Primeiro período:

1. Antes da randomização, todos os pacientes têm um período de observação de 1 mês.
2. A creatina quinase será medida regularmente neste período para definir o nível de dano muscular antes do tratamento.
3. Para determinar uma carga de trabalho de 50% do consumo máximo de oxigênio (VO2máx) para o experimento, todos os sujeitos completarão um teste de exercício de ciclo incremental máximo em um cicloergômetro no final deste período.

Segundo e quarto período:

1. Os indivíduos serão instruídos a seguir uma dieta rica em carboidratos padronizado três dias antes do experimento contendo 65% de carboidratos, 15% de proteínas e 20% de gorduras.
2. Estudo de oxidação de gordura: Após o período de observação de 3 meses, os indivíduos se encontrarão no laboratório às 9h00. Dois cateteres serão inseridos nas veias do braço, um na veia cubital para infusão de isótopos estáveis ​​e outro na veia cefálica distal para coleta de sangue. Os indivíduos receberão uma infusão de taxa constante de [U-13C]-palmitato (0,0026 mg kg-1 min-1, iniciado por um bolus de NaH13CO3 de 0,085 mg kg-1, NB! Traçadores não radioativos e não perigosos) . Duas horas após o início da infusão do isótopo, os sujeitos pedalarão até a exaustão ou por no máximo 60 min. em uma carga de trabalho de 50-60% do VO2max conforme previamente determinado. A frequência cardíaca e o nível de esforço percebido (escala de Borg) serão monitorados a cada dois minutos durante o exercício. Sangue e gases expirados para medidas isotópicas serão coletados em intervalos de 10 minutos em repouso e durante o exercício. O ar expirado será coletado em uma bolsa Douglas de 15 L, e amostras de 10 ml de ar das bolsas serão injetadas em tubos vacutainer para análises de enriquecimento de 13CO2. Amostras de sangue para acil carnitinas serão coletadas após 30 e 60 min. de exercício ou na exaustão, e três horas após o exercício. A atividade enzimática de CPT II e VLCAD será medida em leucócitos. O teste acima descrito será executado antes e depois de cada período de tratamento.
3. Os pacientes serão randomizados em dois grupos, para receber 3 x 200mg de bezafibrato ou placebo no segundo período e vice-versa no quarto período. Os pacientes e todos os profissionais de saúde são cegos para o tratamento. A randomização é realizada pela farmácia regional certificada pela GMP de Copenhague.
4. No primeiro dia de teste desses dois períodos, os pacientes terão amostras de sangue coletadas para analisar creatina quinase, colesterol, triglicerídeos, lipoproteínas, ácidos graxos totais de cadeia longa, carnitina total, acilcarnitinas, bilirrubina, creatinina, aspartato aminotransferase (ASAT), alanina aminotransferase (ALAT), y-glutamiltransferase e fosfatase alcalica.
5. Para indicar seu nível de atividade, os pacientes levarão um acelerômetro nos últimos quatorze dias de cada período de tratamento.

Terceiro período:

1. Período de wash-out de dois meses.
2. Medições dos níveis de creatina quinase a cada duas semanas.

Análise estatística

Cálculo de força:

Duplo-cego, randomizado e cruzado:

(z1-α/2 + Z1-β )2 * SD2 n ≥ _________________________ d2

Z1-α/2 = 1,96; Risco de erro tipo 1 (α=0,05) Z1-β = 0,84; Risco de erro tipo 2: (1-β) = 80% SD2 = 1,25; oxidação delta palmitato em quatro pacientes com deficiência de CPT II = 1,26±1,12 (Ørngreen et al, 2005) d2 = 0,87; (MIREDIF) na oxidação do palmitato durante o exercício, do nível dos pacientes com mutações duplas do gene CPT2 para o nível dos indivíduos com mutação do gene CPT2 único. (Ørngreen e outros, 2005).

(1,96 + 0,84 )2 * 1,25 n ≥ _________________________ = 11 0,87

O cálculo da força é baseado em um estudo anterior de oxidação de gordura em pacientes com deficiência de CPT II. Ørngreen et al 2005 Neste estudo, descrevemos a oxidação de gordura de pacientes e portadores com, respectivamente, duas e uma mutações no gene CPT2 em comparação com a oxidação de gordura em controles saudáveis. Espera-se que o efeito esperado do bezafibrato na oxidação de gordura em pacientes com CPT II seja a diferença entre o valor médio de oxidação de gordura em pacientes com deficiência de CPT II e o valor médio de oxidação de gordura em portadores heterozigotos de uma mutação no gene CPT2. O cálculo da força indica que um número de 11 sujeitos precisa ser incluído. O objetivo é incluir 11 pacientes de, respectivamente, os grupos de pacientes com deficiência de CPT II e os grupos de pacientes com deficiência de VLCAD. Se de alguma forma não pudermos incluir tantos pacientes. Os dois grupos serão agrupados em um único grupo. Isso pode ser feito devido à semelhança dos dois grupos, tanto nos sintomas quanto na oxidação de gordura, que é um dos resultados principais, durante o exercício.Ørngreen et al 2005, Ørngreen et al 2004 Dados ausentes: desde que o paciente tenha concluído pelo menos um período de tratamento, os resultados serão incluídos nos dados. As diferenças entre os tratamentos no indivíduo serão avaliadas por um teste t de Student pareado. Um valor de p < 0,05 (teste bicaudal) será considerado significativo.

Pacientes

Critério de inclusão:

1. Diminuição significativa nas atividades de CPT II ou VLCAD medidas em linfócitos ou fibroblastos, juntamente com verificação genética de deficiência de CPT II ou deficiência de VLCAD.
2. Homens e mulheres de 18 a 65 anos.
3. Todas as mulheres férteis devem ter um teste de gravidez negativo e usar anticoncepcionais durante o período do estudo.

Critério de exclusão:

1. Ingestão de medicamentos concorrentes, conforme descrito no resumo do produto do bezafibrato.
2. Distúrbios competitivos, avaliados pelo patrocinador ou investigadores
3. Gravidez ou lactação durante o período de terapia com fibrato

Parâmetros de segurança:

• CK antes e a cada duas semanas ± uma semana durante o período de tratamento.
• Enzimas hepáticas (AST, ALT, γGT, fosfato alcalino), bilirrubina, creatinina, colesterol, triglicerídeos antes do período de tratamento, em 1 mês ± uma semana e no final do período de tratamento. Amostras de sangue serão coletadas em hospitais locais e os resultados serão enviados por fax ao patrocinador ou aos investigadores.
• Todos os pacientes serão informados a entrar em contato com um dos médicos envolvidos em caso de: 1) sintomas de sua doença ou 2) efeitos colaterais do tratamento.

As etapas a seguir são seguidas para garantir a adesão dos pacientes durante os períodos de tratamento.

• Os pacientes serão contatados semanalmente por correio ou telefone, para garantir que o tratamento seja seguido e que não haja sintomas da doença ou efeitos colaterais do tratamento.
• Caso um dos pacientes se esqueça de seguir a prescrição dos medicamentos, o período de tratamento será prolongado após avaliação do patrocinador ou dos investigadores.

Drogas:

Neste estudo utilizamos o fibrato Bezafibrato. Para obter informações detalhadas sobre efeitos e efeitos colaterais, consulte o arquivo em anexo com o resumo do produto Bezafibrato.

Randomização e não-cegamento: Todos os medicamentos são entregues de forma cega e randomizada na farmácia. Na ocorrência de risco de vida ou outros efeitos colaterais inaceitáveis ​​do tratamento, um paciente pode ser desmascarado após decisão do patrocinador ou investigador. A lista de randomização será mantida pela secretária Malene Kronborg Have e MD Tina Dysgaard Jeppesen na Dinamarca. Essas duas pessoas estão disponíveis 24 horas por dia e não estão envolvidas no estudo de outra forma.