Inaktywacja chromosomu X, epigenetyka i transkryptom

Chromosom X jest kamieniem węgielnym w patogenezie wielu zespołów, z których niektóre to zespół Turnera (45,X), zespół Klinefeltera (47,XXY), zespół potrójnego X (47,XXX) i zespół podwójnego Y (47,XYY) ). Pomimo tego znaczenia dla choroby klinicznej, jak dotąd tylko jeden gen na chromosomie X był zaangażowany w szerokie spektrum cech fenotypowych obserwowanych w tych i innych zespołach związanych z X. Jedynym znanym genem jest gen SHOX (homeobox niskiego wzrostu) i koduje czynnik transkrypcyjny, który ma mózgowy peptyd natriuretyczny (BNP) i gen receptora czynnika wzrostu fibroblastów (FGFR3) jako cele transkrypcyjne. Znajduje się w regionie pseudoautosomalnym chromosomów X i Y. Wykazano, że gen ten bierze udział w niskim wzroście w zespole Turnera, zespole Leri-Weilla i idiopatycznym niskim wzroście. Powoduje również wzrost w zespole Klinefeltera, zespole potrójnego X i zespole XYY.

W zespołach z chromosomem X często obserwuje się wiele cech i chorób, których nie można wyjaśnić tym genem SHOX. Najlepiej scharakteryzowanym z tych zespołów jest zespół Turnera, w którym te cechy fenotypowe można podzielić na:

1. Predylekcja autoimmunologiczna, która prowadzi do zwiększonego ryzyka praktycznie wszystkich chorób autoimmunologicznych o nieznanej patogenezie, takich jak cukrzyca i niedoczynność tarczycy.
2. Zmniejszona żywotność wewnątrzmaciczna. Sugeruje się, że w tym przypadku zaangażowana jest haploinsuficjencja genów pseudoautosomalnych sprzężonych z X działających w łożysku (STS i CSF2RA).
3. Dysgenezja jajników prowadząca do niewydolności jajników i konieczności długotrwałej terapii zastępczej hormonami płciowymi.
4. Wrodzone wady układu sercowo-naczyniowego o nierozwiązanych patogenezach.
5. Rozwój mózgu, zwłaszcza rozwój społeczno-poznawczy, który w wielu przypadkach jest zmieniony, często w kierunku bardziej „męskim”.
6. Zwiększona częstość występowania zespołu metabolicznego i osteoporozy. W komórkach zdrowych kobiet, z dwoma chromosomami X, zachodzi przypadkowa inaktywacja X (13). Proces ten jest zarządzany przez centrum inaktywacji X (XIC) i inicjowany przez Xist, który jest genem kodującym długi niekodujący RNA (lincRNA). Gen Xist znajduje się blisko centromeru na długim ramieniu chromosomu X, skąd koordynuje represyjne modyfikacje histonów (rekrutację PRC2) wzdłuż chromosomu X, prowadząc do inaktywacji. W pozostałym aktywnym chromosomie X PRC2 jest miareczkowany przez Tsix, co skutecznie pozostawia wszystkie kobiety jako mozaikę chromosomu X z jednym pochodzenia matczynego i jednym pochodzenia ojcowskiego. Jednak duża liczba genów rozmieszczonych na chromosomie X unika tej inaktywacji X przez nieznane mechanizmy i zachodzi kompensacja dawki, tak że ekspresja między mężczyznami i kobietami jest porównywalna dla wielu genów (15, 16). Około 65% genów jest całkowicie wyciszonych, podczas gdy 15% całkowicie unika inaktywacji X, a 20% wykazuje zmienną ekspresję, w zależności od pochodzenia komórek tkankowych (17).

LincRNA są powszechnie transkrybowane w genomie, chociaż ich rola w zdrowiu i chorobie jest słabo poznana. Badania nad kompensacją dawki, imprintingiem i homeotyczną ekspresją genów sugerują, że lincRNA działają na styku DNA i przebudowy chromatyny z dalszym udziałem w przeprogramowaniu chromatyny w celu promowania przerzutów raka. Do tej pory postawiono hipotezę o szeregu różnych interakcji lincRNA w regulacji transkrypcji i mogą one funkcjonować zarówno jako nienaruszone cząsteczki oddziałujące, jak i cząsteczki przetworzone przez Dicer, które są cięte na małe interferujące RNA, które degradują inne RNA.

Przebudowę chromatyny można analizować na podstawie śladów pozostawionych przez histony na nici DNA, które mogą mieć charakter permisywny lub represyjny, w zależności od zachodzącej acetylacji lub metylacji histonów. Na przykład trimetylacja lizyny 4 na histonie H3 (H3K4me3) jest wzbogacona w promotory genów aktywnych transkrypcyjnie, podczas gdy trimetylacja H3K9 (H3Kme3) i H3K27 (H3K27me3) jest obecna w promotorach genów, które są represjonowane transkrypcyjnie. Dzięki zastosowaniu immunoprecypitacji chromatyny połączonej z głębokim sekwencjonowaniem (chIPseq) można uzyskać te oznaczenia wzdłuż całego chromosomu X w jednym teście.

Epigenetyczne zmiany modyfikacji histonów można badać za pomocą nowej metodologii, umożliwiającej wykorzystanie stosunkowo starych próbek patologicznych. Otwiera to nowe perspektywy poszerzenia naszej wiedzy na temat roli zezwolenia i inaktywacji chromosomu X w różnych chorobach, gdzie zespoły chromosomu X mogą służyć jako wstępny model do zrozumienia takich procesów, które z dużym prawdopodobieństwem będą istotne dla chorób (np. cukrzyca i niedoczynność tarczycy) poza tymi zespołami. Jako inny przykład, wrodzone wady rozwojowe serca są częste w zespole Turnera i często prowadzą do wczesnego poszerzenia i rozwarstwienia aorty. U tych pacjentów iw grupie kontrolnej pobieramy zatopione w parafinie bloczki tkanki ze ściany aorty, które można teraz ocenić przy użyciu tej pierwszej linii, która może zidentyfikować nowe ślady w DNA pacjentów z zespołem Turnera w porównaniu z DNA pacjentów bez zespołu Turnera.

Imprinting to kolejny ważny aspekt działania chromosomów płciowych. Imprinting odnosi się do procesu, w którym gen (lub więcej genów) może zostać odciśnięty w zależności od pochodzenia rodzicielskiego. Innymi słowy, gen może być „włączony lub wyłączony” w zależności od pochodzenia matczynego lub ojcowskiego. Ponadto badania na myszach pokazują, że klastry genów na chromosomie X są odciskane i są niezależne od inaktywacji chromosomu X.

Znaczenie dziedziczenia biologicznego jest oczywiste w przypadku głównych chorób sercowo-naczyniowych dotykających populację, gdzie cecha dziedziczna wyraźnie dominuje w niektórych rodzinach. Pomimo obietnicy ukierunkowania na zapobieganie i leczenie chorobowości sercowo-naczyniowej, konkretne części genomu, które potencjalnie wywołują patologie, w dużej mierze pozostają do zdefiniowania i mogą przynieść ważną wiedzę na temat patofizjologii.

Główny zasób wiedzy na temat implikacji aberracji genomu pochodzi z chorób z oczywistymi i poważnymi objawami wynikającymi z wyraźnych sposobów przenoszenia, które umożliwiają identyfikację regionów sprawczych genomu. Takie zaburzenia genetyczne mają potencjał do zrozumienia roli określonego locus genomu, jeśli można to zidentyfikować, ponieważ często zaangażowane są duże regiony chromosomalne. W przypadku fenotypów z chromosomem X spodziewamy się, że czynnik sprawczy będzie znajdować się na chromosomie X i będziemy wykorzystywać różne nowe technologie do identyfikacji tego czynnika.

Obecnie nasza ograniczona wiedza na temat znaczenia chromosomu X w patologii układu sercowo-naczyniowego pochodzi z zaburzeń pojedynczego genu i bardziej nieswoistych różnic płciowych oprócz anomalii chromosomów płciowych. W przeciwieństwie do tego, nie ustalono, aby zaburzenie pojedynczego genu na chromosomie Y było związane z chorobowością sercowo-naczyniową.

Dostępne są odpowiednie modele ludzkie dla lepszego zrozumienia roli odgrywanej przez chromosomy płciowe. Tutaj odchylenia od normalności występują nie tylko z rozsądną częstością występowania, ale także wiążą się z łatwymi do zidentyfikowania fenotypami i niekorzystnymi rokowaniami. Takimi modelami są zespoły Turnera i Klinefeltera; odpowiednio u samic ze zmniejszeniem materiału chromosomu X i u samców ze wzrostem materiału chromosomu X. Te anomalie chromosomów płciowych wiążą się z nadmierną chorobowością i śmiertelnością zarówno z powodu wrodzonych, jak i nabytych chorób sercowo-naczyniowych, a także cukrzycy, niewydolności jajników i innych chorób.

Fenotypy sercowo-naczyniowe oraz ekspresja i aktywacja genów są badane u zdrowych kobiet i mężczyzn, porównując zespoły Turnera i Klinefeltera w przekrojowym projekcie opisowym. Badania te zostały już przeprowadzone i ustalona została dokładna charakterystyka. Hipoteza jest taka, że ​​znaczenie chromosomu X przejawia się jako zmienione poziomy ekspresji i aktywacji w związku z różnymi fenotypami sercowo-naczyniowymi. Po drugie, zapewniona jest podstawowa analogiczna wiedza na temat chromosomu Y. Oczekuje się, że projekt wygeneruje dalsze hipotezy dotyczące roli, jaką genom odgrywa w zachorowalności zarówno w populacji z prawidłowym kariotypem, jak iw populacji z nieprawidłowym kariotypem.

W tym projekcie zapewnimy unikalną kombinację technologii molekularnych pierwszej linii i dobrze zdefiniowanych kohort pacjentów. Hipotezy, które będziemy testować, są następujące:

1. Niekodujące transkrypty z chromosomu X odgrywają fundamentalną rolę w nieprawidłowościach chromosomów płciowych i mogą działać poprzez regulację mechanizmów epigenetycznych i poprzez destabilizację mRNA
2. Regulacja ekspresji niekodującego RNA na chromosomach X opiera się na mechanizmach epigenetycznych, które prowadzą do różnych znaków histonowych i różnej metylacji DNA np. u osób z zespołem Turnera i Klinefeltera w porównaniu ze zdrowymi kontrolami dobranymi pod względem płci.
3. Wzorzec ekspresji genów wynikający z tych mechanizmów jest inny w nieprawidłowościach chromosomów płciowych w porównaniu ze zdrowymi mężczyznami i kobietami, a tę różnicę można badać w chorych tkankach kobiet z zespołem Turnera i porównywać z normalną tkanką kontrolną.
4. Możliwe może być zidentyfikowanie jednej lub kilku cząsteczek kierujących w chorych tkankach osób z zespołem Turnera i Klinefeltera, które można zweryfikować in vitro i in vivo i które mogą wyjaśnić procesy chorobowe, dostarczając ważnych informacji patofizjologicznych.

Oczekiwane wyniki. Oczekujemy, że będziemy w stanie zdefiniować zmiany epigenetyczne na chromosomach X w rozdzielczości pojedynczej zasady, identyfikując w ten sposób metylację CpG na niciach DNA, jak również permisywne i represyjne znaki histonowe w histonach.

Oczekujemy identyfikacji transkryptomu zarówno pod względem mRNA, jak i niekodujących RNA (długich i mikroRNA) dla RNA generowanych z chromosomu X.

Oczekujemy, że będziemy w stanie dostarczyć Atlas zdarzeń epigenetycznych specyficznych dla zespołów Turnera i ich wpływu na transkryptom.

Miejmy nadzieję, że przy użyciu metod bioinformatycznych doprowadzi to do identyfikacji nowych rozregulowanych cząsteczek, które mogą wyjaśniać różne właściwości tych pacjentów. Cząsteczki te zostaną następnie poddane walidacji w oddzielnych kohortach pacjentów przy użyciu technologii PCR lub IHC.

W chorej tkance będziemy badać zmiany specyficzne dla tkanki w epigenomie i transkryptomie chromosomów X i porównywać je z normalnymi tkankami z próbek kontrolnych. Mamy nadzieję, że doprowadzi to do identyfikacji czynników napędzających proces chorobowy i zrozumienia patofizjologicznego procesu chorobowego.