X-chromosoominactivatie, epigenetica en het transcriptoom

Het X-chromosoom is een hoeksteen van de pathogenese van een aantal syndromen, waaronder het syndroom van Turner (45,X), het syndroom van Klinefelter (47,XXY), het triple-X-syndroom (47,XXX) en het dubbel-Y-syndroom (47,XYY). ). Ondanks dit belang voor de klinische ziekte, is tot nu toe slechts één gen op het X-chromosoom betrokken bij de brede spectra van fenotypische kenmerken die worden waargenomen bij deze en andere X-gerelateerde syndromen. Het enige bekende gen is het SHOX-gen (het homeobox-gen met korte gestalte) en codeert voor een transcriptiefactor die hersennatriuretisch peptide (BNP) en fibroblastgroeifactorreceptorgen (FGFR3) als transcriptionele doelen heeft. Het bevindt zich in het pseudoautosomale gebied van de X- en Y-chromosomen. Van dit gen is aangetoond dat het betrokken is bij een kleine gestalte bij het syndroom van Turner, het Leri-Weill-syndroom en idiopathische kleine gestalte. Het veroorzaakt ook de toegenomen gestalte bij het Klinefelter-syndroom, het triple-X-syndroom en het XYY-syndroom.

Bij X-chromosomale syndromen wordt een aantal kenmerken en ziekten vaak gezien die niet kunnen worden verklaard door dit SHOX-gen. De best gekarakteriseerde van deze syndromen is het syndroom van Turner, waarbij deze fenotype-eigenschappen kunnen worden onderverdeeld in:

1. Auto-immuunvoorkeur, wat leidt tot een verhoogd risico op vrijwel alle auto-immuunziekten met onbekende pathogenese, zoals diabetes en hypothyreoïdie.
2. Verminderde intra-uteriene levensvatbaarheid. Er is gesuggereerd dat hier haploinsufficiëntie van X-gebonden pseudoautosomale genen die in de placenta werken een rol speelt (STS en CSF2RA).
3. Ovariumdysgenese, leidend tot ovariële insufficiëntie en de noodzaak van langdurige geslachtshormoonsubstitutietherapie.
4. Congenitale cardiovasculaire misvormingen van onopgeloste pathogenese.
5. Hersenontwikkeling, vooral sociaal-cognitieve ontwikkeling, die in veel gevallen veranderd is, vaak in een meer "mannelijke" richting.
6. Verhoogde prevalentie van het metabool syndroom en osteoporose. In gezonde vrouwencellen, met twee X-chromosomen, vindt willekeurige X-inactivatie plaats (13). Het proces wordt bestuurd door het X-inactivatiecentrum (XIC) en geïnitieerd door Xist, een gen dat codeert voor een lang tussenliggend niet-coderend RNA (lincRNA). Het Xist-gen bevindt zich dicht bij het centromeer op de lange arm van het X-chromosoom, van waaruit het repressieve histon-modificaties orkestreert (PRC2 rekruteren) langs het X-chromosoom, wat leidt tot inactivatie. In het resterende actieve X-chromosoom wordt PRC2 weggetitreerd door Tsix, waardoor alle vrouwtjes als mozaïeken overblijven voor het X-chromosoom met een moederlijke en een vaderlijke oorsprong. Een groot aantal genen die verspreid liggen op het X-chromosoom ontsnappen echter door onbekende mechanismen aan deze X-inactivatie en er vindt dosiscompensatie plaats, zodat de expressie tussen mannen en vrouwen voor veel genen vergelijkbaar is (15, 16). Ongeveer 65% van de genen is volledig tot zwijgen gebracht, terwijl 15% volledig aan X-inactivatie ontsnapt en 20% een variabele expressie vertoont, afhankelijk van de oorsprong van de weefselcel (17).

LincRNA's worden alomtegenwoordig getranscribeerd in het genoom, hoewel hun rol in gezondheid en ziekte slecht wordt begrepen. Studies naar doseringscompensatie, imprinting en homeotische genexpressie suggereren dat lincRNA's functioneren op het raakvlak tussen DNA en chromatine-remodellering met verdere betrokkenheid bij herprogrammering van chromatine om kankermetastase te bevorderen. Tot op heden is er een reeks verschillende interacties verondersteld voor lincRNA's bij transcriptionele regulatie, en ze kunnen zowel functioneren als intacte interactiemoleculen als als door Dicer verwerkte moleculen die worden gehakt in kleine interfererende RNA's die andere RNA's afbreken.

Chromatine-remodellering kan worden geanalyseerd aan de hand van de sporen die histonen op de DNA-streng achterlaten, die van tolerante of repressieve aard kunnen zijn, afhankelijk van de acetylering of methylering die plaatsvindt van de histonen. Trimethylering van lysine 4 op histon H3 (H3K4me3) is bijvoorbeeld verrijkt bij transcriptioneel actieve genpromotors, terwijl trimethylering van H3K9 (H3Kme3) en H3K27 (H3K27me3) aanwezig is bij genpromotors die transcriptioneel worden onderdrukt. Door gebruik te maken van chromatine-immunoprecipitatie in combinatie met deep sequencing (chIPseq) kan men deze markeringen langs het hele X-chromosoom in één assay verkrijgen.

De epigenetische veranderingen van histon-modificaties kunnen worden bestudeerd met een nieuwe methodologie, die het gebruik van relatief oude pathologische monsters mogelijk maakt. Dit opent nieuwe perspectieven voor uitbreiding van onze kennis van de rol van de X-chromosomale toestemming en inactivatie bij verschillende ziekten, waarbij X-chromosomale syndromen kunnen dienen als het eerste model om dergelijke processen te begrijpen die zeer waarschijnlijk belangrijk zijn voor ziekten (bijv. diabetes en hypothyreoïdie) naast deze syndromen. Een ander voorbeeld: aangeboren misvormingen van het hart komen vaak voor bij het syndroom van Turner en leiden vaak tot vroege aortadilatatie en -dissectie. Bij deze patiënten en bij controles verzamelen we in paraffine ingebedde weefselblokken van de aortawand, die nu kunnen worden beoordeeld met behulp van deze eerstelijnsmethodologie met het potentieel om nieuwe markeringen op het DNA van Turner-patiënten te identificeren in vergelijking met het DNA van niet-Turner-patiënten.

Inprenting is een ander belangrijk aspect van de werking van geslachtschromosomen. Inprenting verwijst naar het proces waarbij een gen (of meer genen) kan worden ingeprent, afhankelijk van de ouderlijke oorsprong. Anders gezegd, een gen kan worden "aan- of uitgezet", afhankelijk van de moederlijke of vaderlijke oorsprong. Bovendien tonen muizenstudies aan dat clusters van genen op het X-chromosoom zijn ingeprent en onafhankelijk zijn van X-chromosoominactivatie.

Het belang van de biologische overerving is duidelijk voor de belangrijkste cardiovasculaire morbiditeiten die de bevolking treffen, waar een erfelijke eigenschap duidelijk de overhand heeft in bepaalde families. Ondanks een belofte om zich te richten op de preventie en behandeling van cardiovasculaire morbiditeit, moeten de specifieke delen van het genoom die mogelijk de pathologieën veroorzaken grotendeels nog worden gedefinieerd, en zouden belangrijke kennis van de pathofysiologie kunnen opleveren.

Het grootste deel van de kennis over de implicaties van genoomafwijkingen is afkomstig van ziekten met duidelijke en ernstige manifestaties die het gevolg zijn van duidelijke overdrachtswijzen die identificatie van de oorzakelijke regio's van het genoom mogelijk maken. Dergelijke genetische aandoeningen hebben het potentieel om de rol van een specifieke locus van het genoom te begrijpen, als deze kan worden geïdentificeerd, aangezien er vaak grote chromosomale gebieden bij betrokken zijn. In het geval van de X-chromosomale fenotypes verwachten we dat de veroorzaker zich op het X-chromosoom bevindt en zullen we verschillende nieuwe technologieën gebruiken om deze agens te identificeren.

Momenteel is onze beperkte kennis van het belang van het X-chromosoom voor cardiovasculaire pathologie afkomstig van aandoeningen met één gen en meer niet-specifieke geslachtsverschillen naast de geslachtschromosomale anomalieën. Daarentegen is er geen enkel gen-aandoening op het Y-chromosoom vastgesteld die verband houdt met cardiovasculaire morbiditeit.

Geschikte menselijke modellen voor een beter begrip van de rol van de geslachtschromosomen zijn beschikbaar. Afwijkingen van normaliteit komen hier niet alleen met een redelijke prevalentie voor, maar gaan ook gepaard met gemakkelijk identificeerbare fenotypes en ongunstige prognoses. De syndromen van Turner en Klinefelter vormen dergelijke modellen; vrouwen met respectievelijk een vermindering van X-chromosomaal materiaal en mannen met een toename van X-chromosomaal materiaal. Deze anomalieën van de geslachtschromosomen gaan gepaard met overmatige morbiditeit en mortaliteit door zowel aangeboren als verworven cardiovasculaire aandoeningen, diabetes, ovariële insufficiëntie en andere ziekten.

De cardiovasculaire fenotypes en de expressie en activering van genen worden onderzocht bij gezonde vrouwen en mannen met een vergelijking tussen het syndroom van Turner en het syndroom van Klinefelter in een cross-sectioneel beschrijvend ontwerp. Deze onderzoeken zijn al uitgevoerd en er is een nauwkeurige karakterisering vastgesteld. De hypothese is dat de betekenis van het X-chromosoom zich zal manifesteren als veranderde niveaus van expressie en activering in samenhang met verschillende cardiovasculaire fenotypes. Secundair wordt analoge basiskennis van het Y-chromosoom aangereikt. Het project zal naar verwachting verdere hypothesen genereren over de rol die het genoom speelt bij morbiditeit in zowel de populatie met een normaal karyotype als in abnormale karyotypes.

In dit project zullen we een unieke combinatie bieden van frontlinie moleculaire technologieën en goed gedefinieerde patiëntencohorten. De hypothesen die we gaan testen zijn de volgende:

1. Niet-coderende transcripten van het X-chromosoom spelen een fundamentele rol bij geslachtschromosoomafwijkingen en kunnen werken door regulatie van epigenetische mechanismen en door mRNA-destabilisatie
2. De regulatie van niet-coderende RNA-expressie op X-chromosomen is gebaseerd op epigenetische mechanismen die leiden tot verschillende histonmarkeringen en verschillende DNA-methylering bij bijvoorbeeld personen met het syndroom van Turner en Klinefelter in vergelijking met gezonde geslachtsafhankelijke controles.
3. Het genexpressiepatroon dat het gevolg is van deze mechanismen verschilt in geslachtschromosoomafwijkingen in vergelijking met gezonde mannen en vrouwen, en dit verschil kan worden bestudeerd in zieke weefsels van vrouwen met het syndroom van Turner en in vergelijking met normaal controleweefsel.
4. Het zou mogelijk kunnen zijn om één of enkele driver-moleculen te identificeren in zieke weefsels van personen met het syndroom van Turner en Klinefelter, die in vitro en in vivo kunnen worden gevalideerd en die de ziekteprocessen kunnen verklaren, wat belangrijke pathofysiologische informatie oplevert.

Verwachte bevindingen. We verwachten de epigenetische veranderingen op de X-chromosomen te kunnen definiëren met een resolutie van een enkele base, waardoor CpG-methylatie aan de DNA-strengen kan worden geïdentificeerd, evenals permissieve en repressieve histonmarkeringen in histonen.

We verwachten het transcriptoom te identificeren, zowel met betrekking tot mRNA als niet-coderende RNA's (zowel lange als microRNA's) voor RNA's gegenereerd uit het X-chromosoom.

We verwachten een atlas te kunnen geven van de epigenetische gebeurtenissen die specifiek zijn voor Turner-syndromen en de effecten hiervan op het transcriptoom.

Met behulp van bio-informaticamethoden zal dit hopelijk leiden tot de identificatie van nieuwe ontregelde moleculen die verschillende eigenschappen van deze patiënten kunnen verklaren. Deze moleculen zullen vervolgens worden gevalideerd in afzonderlijke patiëntencohorten met behulp van PCR- of IHC-technologie.

In ziek weefsel zullen we de weefselspecifieke veranderingen van het epigenoom en transcriptoom van de X-chromosomen bestuderen en deze vergelijken met normaal weefsel van de controlemonsters. We hopen dat dit zal leiden tot identificatie van de drijfveren van het ziekteproces en een pathofysiologisch begrip van het ziekteproces.