Инактивация Х-хромосомы, эпигенетика и транскриптом

Х-хромосома является краеугольным камнем в патогенезе ряда синдромов, среди которых синдром Тернера (45,X), синдром Клайнфельтера (47,XXY), тройной X-синдром (47,XXX) и двойной Y-синдром (47,XYY). ). Несмотря на эту важность для клинического заболевания, только один ген на Х-хромосоме до сих пор был вовлечен в широкий спектр фенотипических признаков, наблюдаемых при этих и других синдромах, связанных с Х-хромосомой. Одним известным геном является ген SHOX (гомеобокс короткого роста), который кодирует фактор транскрипции, который имеет мозговой натрийуретический пептид (BNP) и ген рецептора фактора роста фибробластов (FGFR3) в качестве мишеней транскрипции. Он расположен в псевдоаутосомной области X и Y хромосом. Было показано, что этот ген вовлечен в низкий рост при синдроме Тернера, синдроме Лери-Вейля и идиопатическом низком росте. Это также вызывает увеличение роста при синдроме Клайнфельтера, синдроме тройной X и синдроме XYY.

Ряд признаков и заболеваний часто наблюдается при Х-хромосомных синдромах, которые не могут быть объяснены этим геном SHOX. Наиболее охарактеризованным из этих синдромов является синдром Тернера, при котором эти черты фенотипа можно разделить на:

1. Аутоиммунная предрасположенность, приводящая к повышенному риску практически всех аутоиммунных заболеваний неизвестного патогенеза, таких как сахарный диабет и гипотиреоз.
2. Снижение внутриутробной жизнеспособности. Предполагается, что здесь замешана гаплонедостаточность Х-сцепленных псевдоаутосомных генов, действующих в плаценте (STS и CSF2RA).
3. Дисгенезия яичников, приводящая к недостаточности яичников и необходимости длительной заместительной терапии половыми гормонами.
4. Врожденные пороки развития сердечно-сосудистой системы неразрешенных патогенезов.
5. Развитие мозга, особенно социально-когнитивное развитие, которое во многих случаях изменяется, часто в более «мужском» направлении.
6. Увеличение распространенности метаболического синдрома и остеопороза. В клетках здоровых женщин с двумя Х-хромосомами происходит случайная инактивация Х (13). Процесс регулируется центром инактивации X (XIC) и инициируется Xist, который представляет собой ген, кодирующий длинную промежуточную некодирующую РНК (lincRNA). Ген Xist расположен близко к центромере на длинном плече Х-хромосомы, откуда он организует репрессивные модификации гистонов (рекрутирование PRC2) вдоль Х-хромосомы, ведущие к инактивации. В оставшейся активной Х-хромосоме PRC2 титруется Tsix, что фактически оставляет всех самок в виде мозаики для Х-хромосомы с одной материнской и одной отцовской. Однако большое количество генов, распределенных по Х-хромосоме, избегают этой Х-инактивации неизвестными механизмами, и имеет место дозовая компенсация, так что экспрессия многих генов у самцов и самок сравнима (15, 16). Приблизительно 65 % генов полностью молчат, в то время как 15 % полностью избегают X-инактивации, а 20 % проявляют переменную экспрессию в зависимости от происхождения тканевых клеток (17).

LincRNAs повсеместно транскрибируются в геноме, хотя их роль в норме и заболевании плохо изучена. Исследования дозовой компенсации, импринтинга и экспрессии гомеозисных генов позволяют предположить, что lincRNAs функционируют на стыке ремоделирования ДНК и хроматина с дальнейшим участием в перепрограммировании хроматина, что способствует метастазированию рака. На сегодняшний день предполагается ряд различных взаимодействий lincRNAs в регуляции транскрипции, и они могут функционировать как интактные взаимодействующие молекулы, так и обработанные Dicer молекулы, которые разрезаются на малые интерферирующие РНК, которые деградируют другие РНК.

Ремоделирование хроматина можно проанализировать по меткам, оставленным гистонами на цепи ДНК, которые могут иметь пермиссивную или репрессивную природу, в зависимости от ацетилирования или метилирования гистонов. Например, триметилирование лизина 4 на гистоне H3 (H3K4me3) обогащено на промоторах транскрипционно активных генов, тогда как триметилирование H3K9 (H3Kme3) и H3K27 (H3K27me3) присутствует на промоторах генов, которые транскрипционно репрессированы. Используя иммунопреципитацию хроматина в сочетании с глубоким секвенированием (chIPseq), можно получить эти метки вдоль всей Х-хромосомы за один анализ.

Эпигенетические изменения модификаций гистонов можно изучать с помощью новой методологии, позволяющей использовать относительно старые патологические образцы. Это открывает новые перспективы для расширения наших знаний о роли разрешения и инактивации Х-хромосомы при различных заболеваниях, где Х-хромосомные синдромы могут служить исходной моделью для понимания таких процессов, которые, скорее всего, важны для болезней (например, диабет и гипотиреоз) помимо этих синдромов. Другой пример: врожденные пороки сердца часто встречаются при синдроме Тернера и часто приводят к ранней дилатации и расслоению аорты. У этих пациентов и в контрольной группе мы собираем залитые в парафин блоки ткани со стенки аорты, которые теперь можно оценить с помощью этой передовой методологии с потенциалом выявления новых меток на ДНК пациентов Тернера по сравнению с ДНК пациентов, не являющихся пациентами Тернера.

Импринтинг — еще один важный аспект действия половых хромосом. Импринтинг относится к процессу, при котором ген (или несколько генов) может импринтироваться в зависимости от родительского происхождения. Иными словами, ген может быть «включен или выключен» в зависимости от его материнского или отцовского происхождения. Кроме того, исследования на мышах показывают, что кластеры генов на Х-хромосоме импринтированы и не зависят от инактивации Х-хромосомы.

Важность биологического наследования очевидна для основных сердечно-сосудистых заболеваний, поражающих население, где в определенных семьях явно преобладает наследственный признак. Несмотря на перспективу нацеливания на профилактику и лечение сердечно-сосудистых заболеваний, конкретные части генома, которые потенциально вызывают патологии, в значительной степени еще предстоит определить и могут дать важные знания о патофизиологии.

Основная часть знаний о последствиях аберраций генома исходит от болезней с очевидными и тяжелыми проявлениями, возникающими в результате четких путей передачи, которые позволяют идентифицировать причинные области генома. Такие генетические нарушения обладают потенциалом для понимания роли определенного локуса генома, если его можно идентифицировать, поскольку часто вовлекаются большие хромосомные области. В случае Х-хромосомных фенотипов мы ожидаем, что возбудитель находится на Х-хромосоме, и мы будем использовать различные новые технологии для идентификации этого агента.

В настоящее время наши ограниченные знания о важности Х-хромосомы для сердечно-сосудистой патологии исходят из нарушений одного гена и более неспецифических гендерных различий в дополнение к аномалиям половых хромосом. Напротив, не было установлено ни одного генетического нарушения на Y-хромосоме, связанного с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Доступны соответствующие человеческие модели для лучшего понимания роли половых хромосом. Здесь отклонения от нормы возникают не только при разумной распространенности, но также связаны с легко идентифицируемыми фенотипами и неблагоприятным прогнозом. Такими моделями являются синдромы Тернера и Клайнфельтера; самки с редукцией Х-хромосомного материала и самцы с увеличением Х-хромосомного материала соответственно. Эти аномалии половых хромосом связаны с повышенной заболеваемостью и смертностью как от врожденных, так и от приобретенных сердечно-сосудистых, а также диабета, недостаточности яичников и других заболеваний.

Сердечно-сосудистые фенотипы, а также экспрессия и активация генов исследуются у здоровых женщин и мужчин путем сравнения синдромов Тернера и Клайнфельтера в поперечном описательном дизайне. Эти исследования уже проведены, и установлена ​​точная характеристика. Гипотеза состоит в том, что значение Х-хромосомы будет проявляться в виде измененных уровней экспрессии и активации в связи с различными сердечно-сосудистыми фенотипами. Во-вторых, базовые аналогичные знания даются об Y-хромосоме. Ожидается, что проект позволит выдвинуть дальнейшие гипотезы о роли генома в заболеваемости как в популяции с нормальным кариотипом, так и в популяции с аномальным кариотипом.

В этом проекте мы предоставим уникальное сочетание передовых молекулярных технологий и четко определенных групп пациентов. Гипотезы, которые мы будем проверять, следующие:

1. Некодирующие транскрипты Х-хромосомы играют фундаментальную роль в аномалиях половых хромосом и могут действовать посредством регуляции эпигенетических механизмов и дестабилизации мРНК.
2. Регуляция экспрессии некодирующей РНК на Х-хромосомах основана на эпигенетических механизмах, которые приводят к различным гистоновым меткам и различному метилированию ДНК, например, у людей с синдромом Тернера и Клайнфельтера по сравнению со здоровыми людьми того же пола.
3. Паттерн экспрессии генов, возникающий в результате этих механизмов, отличается при аномалиях половых хромосом по сравнению со здоровыми мужчинами и женщинами, и это различие можно изучить в больных тканях женщин с синдромом Тернера и по сравнению с нормальной контрольной тканью.
4. Возможно, удастся идентифицировать одну или несколько молекул-драйверов в пораженных тканях у людей с синдромами Тернера и Клайнфельтера, которые можно подтвердить in vitro и in vivo и которые могут объяснять болезненные процессы, предоставляя важную патофизиологическую информацию.

Ожидаемые выводы. Мы ожидаем, что сможем определить эпигенетические изменения в Х-хромосомах с разрешением в одно основание, таким образом идентифицируя метилирование CpG в цепях ДНК, а также пермиссивные и репрессивные гистоновые метки в гистонах.

Мы ожидаем идентифицировать транскриптом как в отношении мРНК, так и некодирующих РНК (длинных, а также микроРНК) для РНК, генерируемых из Х-хромосомы.

Мы надеемся, что сможем предоставить атлас эпигенетических событий, характерных для синдромов Тернера, и их влияние на транскриптом.

Мы надеемся, что использование биоинформационных методов приведет к идентификации новых молекул с нарушенной регуляцией, которые могут объяснить различные свойства этих пациентов. Затем эти молекулы будут проверены в отдельных когортах пациентов с использованием технологии ПЦР или ИГХ.

В больной ткани мы изучим тканеспецифические изменения эпигенома и транскриптома Х-хромосом и сравним их с нормальными тканями из контрольных образцов. Мы надеемся, что это приведет к выявлению движущих сил болезненного процесса и патофизиологическому пониманию болезненного процесса.