X-Chromosom-Inaktivierung, Epigenetik und das Transkriptom

Das X-Chromosom ist ein Eckpfeiler der Pathogenese einer Reihe von Syndromen, von denen einige das Turner-Syndrom (45,X), das Klinefelter-Syndrom (47,XXY), das Triple-X-Syndrom (47,XXX) und das Doppel-Y-Syndrom (47,XYY) sind ). Trotz dieser Bedeutung für die klinische Erkrankung wurde bisher nur ein Gen auf dem X-Chromosom in das breite Spektrum phänotypischer Merkmale verwickelt, die bei diesen und anderen X-bezogenen Syndromen beobachtet werden. Das einzige bekannte Gen ist das SHOX-Gen (das kleinwüchsige Homöobox-Gen) und kodiert einen Transkriptionsfaktor, der das natriuretische Peptid des Gehirns (BNP) und das Gen des Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptors (FGFR3) als transkriptionelle Ziele hat. Es befindet sich in der pseudoautosomalen Region der X- und Y-Chromosomen. Es wurde gezeigt, dass dieses Gen an Kleinwuchs beim Turner-Syndrom, Leri-Weill-Syndrom und idiopathischem Kleinwuchs beteiligt ist. Es verursacht auch die erhöhte Statur beim Klinefelter-Syndrom, Triple-X-Syndrom und XYY-Syndrom.

Bei X-chromosomalen Syndromen treten häufig eine Reihe von Merkmalen und Krankheiten auf, die nicht durch dieses SHOX-Gen erklärt werden können. Das am besten charakterisierte dieser Syndrome ist das Turner-Syndrom, bei dem diese Phänotypmerkmale unterteilt werden können in:

1. Autoimmunprädilektion, die zu einem erhöhten Risiko für praktisch alle Autoimmunerkrankungen unbekannter Pathogenese wie Diabetes und Hypothyreose führt.
2. Verringerte intrauterine Lebensfähigkeit. Hier wurde vermutet, dass eine Haploinsuffizienz von X-chromosomalen pseudoautosomalen Genen, die in der Plazenta operieren, beteiligt ist (STS und CSF2RA).
3. Ovarielle Dysgenesie, die zu Ovarialinsuffizienz und der Notwendigkeit einer langfristigen Sexualhormonersatztherapie führt.
4. Angeborene kardiovaskuläre Fehlbildungen ungeklärter Pathogenesen.
5. Die Gehirnentwicklung, insbesondere die sozial-kognitive Entwicklung, die in vielen Fällen verändert ist, oft in eine "männlichere" Richtung.
6. Erhöhte Prävalenz des metabolischen Syndroms und Osteoporose. In gesunden Frauenzellen mit zwei X-Chromosomen findet eine zufällige X-Inaktivierung statt (13). Der Prozess wird durch das X-Inaktivierungszentrum (XIC) gesteuert und durch Xist initiiert, das ein Gen ist, das für eine lange intervenierende nicht-kodierende RNA (lincRNA) kodiert. Das Xist-Gen befindet sich in der Nähe des Zentromers auf dem langen Arm des X-Chromosoms, von wo aus es repressive Histonmodifikationen (Rekrutierung von PRC2) entlang des X-Chromosoms orchestriert, was zur Inaktivierung führt. Im verbleibenden aktiven X-Chromosom wird PRC2 durch Tsix wegtitriert, was effektiv alle Frauen als Mosaike für das X-Chromosom mit einem mütterlichen und einem väterlichen Ursprung hinterlässt. Allerdings entgeht eine Vielzahl von Genen, die auf dem X-Chromosom verteilt sind, dieser X-Inaktivierung durch unbekannte Mechanismen und es findet ein Dosisausgleich statt, so dass die Expression zwischen Männchen und Weibchen für viele Gene vergleichbar ist (15, 16). Ungefähr 65 % der Gene sind vollständig stillgelegt, während 15 % der X-Inaktivierung vollständig entkommen und 20 % je nach Herkunft der Gewebezellen eine variable Expression aufweisen (17).

LincRNAs werden im Genom allgegenwärtig transkribiert, obwohl ihre Rolle bei Gesundheit und Krankheit kaum verstanden wird. Studien zur Dosiskompensation, Imprinting und homöotischen Genexpression deuten darauf hin, dass lincRNAs an der Schnittstelle zwischen DNA- und Chromatin-Remodeling fungieren, mit weiterer Beteiligung an der Reprogrammierung von Chromatin zur Förderung der Krebsmetastasierung. Bis heute wurde eine Reihe verschiedener Wechselwirkungen für lincRNAs bei der Transkriptionsregulation angenommen, und sie können sowohl als intakte interagierende Moleküle als auch als Dicer-prozessierte Moleküle fungieren, die in kleine interferierende RNAs zerhackt werden, die andere RNAs abbauen.

Der Chromatin-Umbau kann anhand der Markierungen analysiert werden, die Histone auf dem DNA-Strang hinterlassen, die je nach Acetylierung oder Methylierung der Histone entweder permissiver oder repressiver Natur sein können. Beispielsweise ist die Trimethylierung von Lysin 4 auf Histon H3 (H3K4me3) an transkriptionell aktiven Genpromotoren angereichert, während die Trimethylierung von H3K9 (H3Kme3) und H3K27 (H3K27me3) an Genpromotoren vorhanden ist, die transkriptionell reprimiert sind. Durch Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation in Verbindung mit Deep Sequencing (chIPseq) kann man diese Markierungen entlang des gesamten X-Chromosoms in einem Assay erhalten.

Die epigenetischen Veränderungen von Histonmodifikationen können mit einer neuen Methodik untersucht werden, die die Verwendung relativ alter pathologischer Proben ermöglicht. Dies eröffnet neue Perspektiven für die Erweiterung unseres Wissens über die Rolle der X-chromosomalen Zulassung und Inaktivierung bei verschiedenen Krankheiten, wobei X-chromosomale Syndrome als erstes Modell zum Verständnis solcher Prozesse dienen können, die mit hoher Wahrscheinlichkeit für Krankheiten wichtig sind (z. Diabetes und Hypothyreose) über diese Syndrome hinaus. Als weiteres Beispiel sind angeborene Fehlbildungen des Herzens beim Turner-Syndrom häufig und führen häufig zu einer frühen Aortendilatation und -dissektion. Bei diesen Patienten und bei Kontrollen sammeln wir in Paraffin eingebettete Gewebeblöcke aus der Aortenwand, die nun mit dieser Frontline-Methodik bewertet werden können, mit dem Potenzial, neue Markierungen auf der DNA von Turner-Patienten im Vergleich zur DNA von Nicht-Turner-Patienten zu identifizieren.

Das Imprinting ist ein weiterer wichtiger Aspekt der Wirkung der Geschlechtschromosomen. Prägung bezieht sich auf den Prozess, bei dem ein Gen (oder mehrere Gene) je nach elterlicher Herkunft eingeprägt werden können. Anders ausgedrückt, ein Gen kann abhängig von seinem mütterlichen oder väterlichen Ursprung "ein- oder ausgeschaltet" werden. Darüber hinaus zeigen Mausstudien, dass Gencluster auf dem X-Chromosom geprägt und unabhängig von der Inaktivierung des X-Chromosoms sind.

Die Bedeutung der biologischen Vererbung ist offensichtlich für die großen kardiovaskulären Morbiditäten, die die Bevölkerung betreffen, wo ein erbliches Merkmal in bestimmten Familien eindeutig vorherrscht. Trotz des Versprechens, auf die Prävention und Behandlung von kardiovaskulärer Morbidität abzuzielen, müssen die spezifischen Teile des Genoms, die möglicherweise die Pathologien auslösen, weitgehend noch definiert werden und könnten wichtige Erkenntnisse über die Pathophysiologie bringen.

Der größte Teil des Wissens über die Auswirkungen von Genomaberrationen stammt von Krankheiten mit offensichtlichen und schwerwiegenden Manifestationen, die sich aus eindeutigen Übertragungswegen ergeben, die eine Identifizierung der ursächlichen Regionen des Genoms ermöglichen. Solche genetischen Störungen bergen das Potenzial, die Rolle eines bestimmten Locus des Genoms zu verstehen, wenn dieser identifiziert werden kann, da oft große chromosomale Regionen beteiligt sind. Im Fall der X-chromosomalen Phänotypen erwarten wir, dass der Erreger auf dem X-Chromosom liegt, und werden verschiedene neue Technologien verwenden, um diesen Erreger zu identifizieren.

Derzeit stammt unser begrenztes Wissen über die Bedeutung des X-Chromosoms für die kardiovaskuläre Pathologie von Einzelgenstörungen und mehr unspezifischen Geschlechtsunterschieden zusätzlich zu den geschlechtschromosomalen Anomalien. Im Gegensatz dazu wurde keine Störung eines einzelnen Gens auf dem Y-Chromosom festgestellt, die mit kardiovaskulärer Morbidität in Zusammenhang steht.

Geeignete menschliche Modelle zum besseren Verständnis der Rolle der Geschlechtschromosomen sind verfügbar. Hier treten Abweichungen von der Normalität nicht nur mit einer angemessenen Prävalenz auf, sondern sind auch mit leicht identifizierbaren Phänotypen und einer ungünstigen Prognose verbunden. Turner- und Klinefelter-Syndrome bilden solche Modelle; Frauen mit einer Verringerung des X-chromosomalen Materials bzw. Männer mit einer Zunahme des X-chromosomalen Materials. Diese Anomalien der Geschlechtschromosomen sind mit einer übermäßigen Morbidität und Mortalität sowohl durch angeborene als auch erworbene kardiovaskuläre sowie Diabetes, Ovarialinsuffizienz und andere Krankheiten verbunden.

Die kardiovaskulären Phänotypen sowie die Expression und Aktivierung von Genen werden bei gesunden Frauen und Männern mit einem Vergleich zwischen Turner- und Klinefelter-Syndrom in einem deskriptiven Querschnittsdesign untersucht. Diese Studien wurden bereits durchgeführt und eine genaue Charakterisierung wurde erstellt. Die Hypothese ist, dass sich die Bedeutung des X-Chromosoms als veränderte Expressions- und Aktivierungsniveaus in Verbindung mit verschiedenen kardiovaskulären Phänotypen manifestieren wird. Sekundär werden analoge Grundkenntnisse des Y-Chromosoms vermittelt. Es wird erwartet, dass das Projekt weitere Hypothesen über die Rolle aufstellt, die das Genom für die Morbidität sowohl in der Bevölkerung mit einem normalen Karyotyp als auch bei abnormen Karyotypen spielt.

In diesem Projekt werden wir eine einzigartige Kombination aus molekularen Spitzentechnologien und gut definierten Patientenkohorten bereitstellen. Die Hypothesen, die wir testen werden, sind die folgenden:

1. Nichtkodierende Transkripte des X-Chromosoms spielen eine grundlegende Rolle bei Anomalien der Geschlechtschromosomen und wirken möglicherweise durch die Regulierung epigenetischer Mechanismen und durch mRNA-Destabilisierung
2. Die Regulation der nichtkodierenden RNA-Expression auf X-Chromosomen basiert auf epigenetischen Mechanismen, die zu unterschiedlichen Histonmarkierungen und unterschiedlicher DNA-Methylierung bei z. B. Turner- und Klinefelter-Syndrom-Personen im Vergleich zu gesunden geschlechtsangepassten Kontrollen führen.
3. Das aus diesen Mechanismen resultierende Genexpressionsmuster unterscheidet sich bei Geschlechtschromosomenanomalien im Vergleich zu gesunden Männern und Frauen, und dieser Unterschied kann in erkrankten Geweben von Turner-Syndrom-Frauen und im Vergleich zu normalem Kontrollgewebe untersucht werden.
4. Es kann möglich sein, ein oder wenige Treibermoleküle in erkrankten Geweben von Personen mit Turner- und Klinefelter-Syndrom zu identifizieren, die in vitro und in vivo validiert werden können und die Krankheitsprozesse erklären können, indem sie wichtige pathophysiologische Informationen liefern.

Erwartete Erkenntnisse. Wir gehen davon aus, dass wir in der Lage sein werden, die epigenetischen Veränderungen an den X-Chromosomen mit einer einzigen Basenauflösung zu definieren und so die CpG-Methylierung an den DNA-Strängen sowie permissive und repressive Histonmarkierungen in Histonen zu identifizieren.

Wir erwarten, das Transkriptom sowohl in Bezug auf mRNA als auch nicht-kodierende RNAs (sowohl lange als auch microRNAs) für RNAs zu identifizieren, die vom X-Chromosom generiert werden.

Wir erwarten, einen Atlas der für Turner-Syndrome spezifischen epigenetischen Ereignisse und deren Auswirkungen auf das Transkriptom bereitstellen zu können.

Mithilfe bioinformatischer Methoden wird dies hoffentlich zur Identifizierung neuer dysregulierter Moleküle führen, die verschiedene Eigenschaften dieser Patienten erklären können. Diese Moleküle werden dann in separaten Patientenkohorten mittels PCR- oder IHC-Technologie validiert.

In erkranktem Gewebe untersuchen wir die gewebespezifischen Veränderungen des Epigenoms und Transkriptoms der X-Chromosomen und vergleichen diese mit normalen Geweben aus den Kontrollproben. Wir hoffen, dass dies zur Identifizierung der Treiber des Krankheitsprozesses und zu einem pathophysiologischen Verständnis des Krankheitsprozesses führen wird.