X-kromosominaktivering, epigenetik og transkriptomet

X-kromosomet er en hjørnesten i patogenesen af ​​en række syndromer, hvoraf nogle er Turner syndrom (45,X), Klinefelter syndrom (47,XXY), triple X syndrom (47,XXX) og dobbelt Y syndrom (47,XYY) ). På trods af denne betydning for klinisk sygdom, er kun ét gen på X-kromosomet hidtil blevet impliceret i det brede spektrum af fænotypiske træk, der ses i disse og andre X-relaterede syndromer. Det ene kendte gen er SHOX-genet (det korte statur-homeobox)-gen og koder for en transkriptionsfaktor, der har hjernens natriuretiske peptid (BNP) og fibroblast-vækstfaktorreceptorgenet (FGFR3) som transkriptionelle mål. Det er placeret i den pseudoautosomale region af X- og Y-kromosomerne. Dette gen har vist sig at være involveret i kort statur i Turners syndrom, Leri-Weill syndrom og idiopatisk kort statur. Det forårsager også den øgede statur i Klinefelter syndrom, triple X syndrom og XYY syndrom.

En række træk og sygdomme ses hyppigt ved X-kromosomale syndromer, som ikke kan forklares med dette SHOX-gen. Det bedst karakteriserede af disse syndromer er Turners syndrom, hvor disse fænotypetræk kan opdeles i:

1. Autoimmun forkærlighed, som fører til en øget risiko for stort set alle autoimmune sygdomme med ukendt patogenese som diabetes og hypothyroidisme.
2. Nedsat intrauterin levedygtighed. Her er haploinsufficiens af X-bundne pseudoautosomale gener, der opererer i placenta, blevet foreslået at være involveret (STS og CSF2RA).
3. Dysgenese i æggestokkene, hvilket fører til ovarieinsufficiens og behovet for langvarig kønshormonerstatningsterapi.
4. Medfødte kardiovaskulære misdannelser af uløste patogeneser.
5. Hjernens udvikling, især social-kognitiv udvikling, som i mange tilfælde ændres, ofte i en mere "mandslignende" retning.
6. Øget forekomst af metabolisk syndrom og osteoporose. I raske kvindeceller med to X-kromosomer sker tilfældig X-inaktivering (13). Processen styres af X-inaktiveringscentret (XIC) og initieres af Xist, som er et gen, der koder for et langt mellemliggende ikke-kodende RNA (lincRNA). Xist-genet er placeret tæt på centromeren på den lange arm af X-kromosomet, hvorfra det orkestrerer repressive histonmodifikationer (rekrutterer PRC2) langs X-kromosomet, hvilket fører til inaktivering. I det resterende aktive X-kromosom titreres PRC2 væk af Tsix, som effektivt efterlader alle hunner som mosaikker til X-kromosomet med en af ​​moderlig og en af ​​faderlig oprindelse. Men et stort antal gener, der er spredt ud på X-kromosomet, undslipper denne X-inaktivering ved ukendte mekanismer, og dosiskompensation finder sted, således at ekspressionen mellem hanner og hunner er sammenlignelige for mange gener (15, 16). Ca. 65 % af generne er fuldstændigt dæmpede, mens 15 % helt undslipper X-inaktivering, og 20 % viser variabel ekspression, afhængig af vævscelleoprindelse (17).

LincRNA'er transskriberes gennemtrængende i genomet, selvom deres rolle i sundhed og sygdom er dårligt forstået. Undersøgelser af dosiskompensation, prægning og homøotisk genekspression tyder på, at lincRNA'er fungerer ved grænsefladen mellem DNA og kromatin-ombygning med yderligere involvering i omprogrammering af kromatin for at fremme cancermetastaser. Til dato er der antaget en række forskellige interaktioner for lincRNA'er i transkriptionel regulering, og de kan fungere både som intakte interagerende molekyler såvel som Dicer-behandlede molekyler, der er hakket i små interfererende RNA'er, der nedbryder andre RNA'er.

Chromatin-remodellering kan analyseres ved de mærker, som histoner efterlader på DNA-strengen, som kan være af enten permissiv eller undertrykkende karakter, afhængigt af den acetylering eller methylering, der finder sted af histonerne. Som et eksempel er trimethylering af lysin 4 på histon H3 (H3K4me3) beriget ved transkriptionelt aktive genpromotorer, hvorimod trimethylering af H3K9 (H3Kme3) og H3K27 (H3K27me3) er til stede ved genpromotorer, der er transkriptionelt undertrykte. Ved brug af kromatin-immunpræcipitation kombineret med dyb sekventering (chIPseq) kan man opnå disse mærker langs hele X-kromosomet i et assay.

De epigenetiske ændringer af histonmodifikationer kan studeres med en ny metodologi, der muliggør brugen af ​​relativt gamle patologiske prøver. Dette åbner nye perspektiver for udvidelse af vores viden om rollen af ​​den X-kromosomale tilladelse og inaktivering for forskellige sygdomme, hvor X-kromosomale syndromer kan tjene som den indledende model til at forstå sådanne processer, der med stor sandsynlighed er vigtige for sygdomme (f. diabetes og hypothyroidisme) ud over disse syndromer. Som et andet eksempel er medfødte misdannelser af hjertet hyppige ved Turners syndrom og fører ofte til tidlig aortadilatation og dissektion. Hos disse patienter og i kontroller indsamler vi paraffinindlejrede vævsblokke fra aortavæggen, som nu kan vurderes ved hjælp af denne frontlinjemetodologi med potentiale til at identificere nye mærker på Turner-patienters DNA sammenlignet med DNA'et fra ikke-Turner-patienter.

Prægning er et andet vigtigt aspekt af kønskromosomhandling. Prægning refererer til den proces, hvor et gen (eller flere gener) kan præges afhængigt af forældrenes oprindelse. Sagt på en anden måde kan et gen "tændes eller slukkes" afhængigt af dets moder af faderlig oprindelse. Desuden viser museundersøgelser, at klynger af gener på X-kromosomet er præget og er uafhængige af X-kromosominaktivering.

Betydningen af ​​den biologiske arv er tydelig for de store kardiovaskulære sygdomme, der rammer befolkningen, hvor en arvelig egenskab tydeligvis hersker i visse familier. På trods af et løfte om at målrette forebyggelse og behandling af kardiovaskulær sygelighed, er de specifikke dele af genomet, der potentielt udløser patologierne, stort set endnu at blive defineret, og de kunne bringe vigtig viden om patofysiologien.

Den største viden om implikationerne af genom-aberrationer stammer fra sygdomme med tydelige og alvorlige manifestationer som følge af klare transmissionsmåder, der tillader identifikation af de forårsagende regioner af genomet. Sådanne genetiske lidelser rummer potentialet til at forstå rollen af ​​et specifikt locus af genomet, hvis dette kan identificeres, da store kromosomale områder ofte er involveret. I tilfælde af de X-kromosomale fænotyper forventer vi, at det forårsagende middel er på X-kromosomet, og vi vil bruge forskellige nye teknologier til at identificere dette middel.

I øjeblikket kommer vores begrænsede viden om X-kromosomets betydning for kardiovaskulær patologi fra enkelt-gen-lidelser og mere uspecifikke kønsforskelle ud over de kønskromosomale anomalier. I modsætning hertil er der ikke påvist nogen enkelt-gen lidelse på Y-kromosomet at være relateret til kardiovaskulær morbiditet.

Der findes passende menneskelige modeller til forbedret forståelse af kønskromosomes rolle. Her forekommer afvigelser fra normalitet ikke kun med en rimelig prævalens, men er også forbundet med let identificerbare fænotyper og ugunstig prognose. Turner og Klinefelters syndromer udgør sådanne modeller; henholdsvis hunner med en reduktion i X-kromosomalt materiale og hanner med en stigning i X-kromosomalt materiale. Disse anomalier i kønskromosomerne er forbundet med overskydende morbiditet og dødelighed fra både medfødt og erhvervet kardiovaskulær samt diabetes, ovarieinsufficiens og andre sygdomme.

De kardiovaskulære fænotyper og ekspressionen og aktiveringen af ​​gener undersøges hos raske kvinder og mænd med en sammenligning mellem Turner og Klinefelters syndromer i et tværsnitsdeskriptivt design. Disse undersøgelser er allerede udført, og en præcis karakterisering er etableret. Hypotesen er, at X-kromosomets betydning vil vise sig som ændrede niveauer af udtryk og aktivering i forbindelse med forskellige kardiovaskulære fænotyper. Sekundært gives grundlæggende analog viden om Y-kromosomet. Projektet forventes at generere yderligere hypoteser om den rolle, som genomet spiller for sygelighed i både befolkningen med en normal karyotype såvel som i unormale karyotyper.

I dette projekt vil vi levere en unik kombination af frontlinje molekylære teknologier og veldefinerede patientkohorter. De hypoteser, vi vil teste, er følgende:

1. Ikke-kodende transkripter fra X-kromosomet spiller en fundamental rolle i kønskromosomabnormaliteter og kan virke gennem regulering af epigenetiske mekanismer og gennem mRNA-destabilisering
2. Reguleringen af ​​ikke-kodende RNA-ekspression på X-kromosomer er baseret på epigenetiske mekanismer, der fører til forskellige histonmærker og forskellig DNA-methylering hos f.eks. Turner og Klinefelters syndrom personer sammenlignet med raske kønsmatchede kontroller.
3. Genekspressionsmønsteret som følge af disse mekanismer er forskelligt i kønskromosomabnormaliteter sammenlignet med raske mænd og kvinder, og denne forskel kan studeres i syge væv fra Turners syndrom kvinder og sammenlignes med normalt kontrolvæv.
4. Det kan være muligt at identificere et eller nogle få drivermolekyler i syge væv fra Turner og Klinefelters syndrom personer, som kan valideres in vitro og in vivo, og som kan forklare sygdomsprocesserne, hvilket giver vigtig patofysiologisk information.

Forventede fund. Vi forventer at være i stand til at definere de epigenetiske ændringer ved X-kromosomerne ved en enkelt baseopløsning og dermed identificere CpG-methylering ved DNA-strengene samt tilladelige og undertrykkende histonmærker i histoner.

Vi forventer at identificere transkriptomet både med hensyn til mRNA og ikke-kodende RNA'er (lange såvel som mikroRNA'er) for RNA'er genereret fra X-kromosomet.

Vi forventer at kunne give et atlas over de epigenetiske hændelser, der er specifikke for Turners syndromer og virkningerne af disse på transkriptomet.

Ved at bruge bioinformatiske metoder vil dette forhåbentlig føre til identifikation af nye dysregulerede molekyler, der kan forklare forskellige egenskaber hos disse patienter. Disse molekyler vil derefter blive genstand for validering i separate patientkohorter ved hjælp af PCR- eller IHC-teknologi.

I sygt væv vil vi studere de vævsspecifikke ændringer af epigenomet og transkriptomet af X-kromosomerne og sammenligne dette med normalt væv fra kontrolprøverne. Vi håber, at dette vil føre til identifikation af driverne bag sygdomsprocessen og en patofysiologisk forståelse af sygdomsprocessen.