Inaktivace X-chromozomu, epigenetika a transkriptom

Chromozom X je základním kamenem patogeneze řady syndromů, z nichž některé jsou Turnerův syndrom (45, X), Klinefelterův syndrom (47, XXY), syndrom trojitého X (47, XXX) a syndrom dvojitého Y (47, XYY ). Navzdory této důležitosti pro klinické onemocnění byl dosud pouze jeden gen na chromozomu X zapojen do širokého spektra fenotypových znaků pozorovaných u těchto a dalších syndromů souvisejících s X. Jedním známým genem je gen SHOX (homeobox krátkého vzrůstu) a kóduje transkripční faktor, který má jako transkripční cíle mozkový natriuretický peptid (BNP) a gen receptoru fibroblastového růstového faktoru (FGFR3). Nachází se v pseudoautozomální oblasti chromozomů X a Y. Bylo prokázáno, že tento gen se podílí na malém vzrůstu u Turnerova syndromu, Leri-Weillova syndromu a idiopatické nízké postavy. Také způsobuje zvýšenou postavu u Klinefelterova syndromu, syndromu trojitého X a XYY syndromu.

U X-chromozomálních syndromů se často vyskytuje řada znaků a nemocí, které nelze vysvětlit tímto genem SHOX. Nejlépe charakterizovaným z těchto syndromů je Turnerův syndrom, kde lze tyto fenotypové rysy rozdělit na:

1. Autoimunitní predilekce, která vede ke zvýšenému riziku prakticky všech autoimunitních onemocnění neznámé patogeneze jako je diabetes a hypotyreóza.
2. Snížená intrauterinní životaschopnost. Zde se předpokládá, že se jedná o haploinsuficienci X-vázaných pseudoautozomálních genů působících v placentě (STS a CSF2RA).
3. Ovariální dysgeneze vedoucí k ovariální insuficienci a potřebě dlouhodobé substituční terapie pohlavními hormony.
4. Vrozené kardiovaskulární malformace nevyřešených patogenezí.
5. Vývoj mozku, zejména sociálně-kognitivní vývoj, který je v mnoha případech pozměněn, často spíše „mužským“ směrem.
6. Zvýšená prevalence metabolického syndromu a osteoporózy. Ve zdravých ženských buňkách se dvěma X-chromozomy probíhá náhodná X inaktivace (13). Proces je řízen X inaktivačním centrem (XIC) a iniciován Xist, což je gen kódující dlouho intervenující nekódující RNA (lincRNA). Gen Xist se nachází v blízkosti centromery na dlouhém raménku chromozomu X, kde z něj organizuje represivní modifikace histonů (nabírání PRC2) podél chromozomu X vedoucí k inaktivaci. Ve zbývajícím aktivním chromozomu X je PRC2 titrován pomocí Tsix, což efektivně zanechává všechny ženy jako mozaiky pro chromozom X s jedním z mateřského a jedním z otcovského původu. Velké množství genů, které jsou rozmístěny na chromozomu X, však této X-inaktivaci neznámými mechanismy uniká a dochází ke kompenzaci dávky, takže exprese mezi muži a ženami je u mnoha genů srovnatelná (15, 16). Přibližně 65 % genů je plně umlčeno, zatímco 15 % zcela unikne X-inaktivaci a 20 % vykazuje variabilní expresi v závislosti na původu tkáňových buněk (17).

LincRNA jsou všudypřítomné transkribované v genomu, ačkoli jejich role ve zdraví a nemoci je špatně pochopena. Studie kompenzace dávky, imprintingu a homeotické genové exprese naznačují, že lincRNA fungují na rozhraní mezi DNA a remodelací chromatinu s dalším zapojením do přeprogramování chromatinu k podpoře metastázování rakoviny. K dnešnímu dni se předpokládá řada různých interakcí pro lincRNA v transkripční regulaci a mohou fungovat jak jako intaktní interagující molekuly, tak jako molekuly zpracované Dicerem, které jsou nasekány na malé interferující RNA, které degradují jiné RNA.

Remodelaci chromatinu lze analyzovat podle značek zanechaných histony na řetězci DNA, které mohou mít buď permisivní nebo represivní povahu, v závislosti na acetylaci nebo metylaci, ke které dochází u histonů. Například trimethylace lysinu 4 na histonu H3 (H3K4me3) je obohacena o transkripčně aktivní genové promotory, zatímco trimethylace H3K9 (H3Kme3) a H3K27 (H3K27me3) je přítomna u genových promotorů, které jsou transkripčně potlačeny. Použitím chromatinové imunoprecipitace spojené s hlubokým sekvenováním (chIPseq) lze získat tyto značky podél celého X chromozomu v jednom testu.

Epigenetické alterace modifikací histonů lze studovat novou metodikou, která umožňuje použití relativně starých patologických vzorků. To otevírá nové vyhlídky pro rozšíření našich znalostí o úloze povolení a inaktivace X-chromozomů na různá onemocnění, kde X-chromozomální syndromy mohou sloužit jako výchozí model pro pochopení takových procesů, které jsou vysoce pravděpodobně důležité pro nemoci (např. diabetes a hypotyreóza) mimo tyto syndromy. Jako další příklad, vrozené malformace srdce jsou časté u Turnerova syndromu a často vedou k časné dilataci a disekci aorty. U těchto pacientů au kontrol sbíráme bloky tkáně zalité v parafínu ze stěny aorty, které lze nyní hodnotit pomocí této metodologie první linie s potenciálem identifikovat nové značky na DNA Turnerových pacientů ve srovnání s DNA pacientů, kteří nejsou Turnerovými.

Imprinting je dalším důležitým aspektem působení pohlavních chromozomů. Imprinting se týká procesu, kdy gen (nebo více genů) může být otištěn v závislosti na rodičovském původu. Jinými slovy, gen lze „zapnout nebo vypnout“ v závislosti na jeho mateřském původu. Kromě toho studie na myších ukazují, že shluky genů na chromozomu X jsou otištěny a jsou nezávislé na inaktivaci chromozomu X.

Význam biologické dědičnosti je zřejmý pro hlavní kardiovaskulární morbidity postihující populaci, kde v některých rodinách jednoznačně převažuje dědičný znak. Navzdory příslibu zacílení na prevenci a léčbu kardiovaskulární morbidity zbývá definovat specifické části genomu, které potenciálně spouštějí patologie, a mohly by přinést důležité poznatky o patofyziologii.

Hlavní soubor znalostí o důsledcích genomových aberací pochází z nemocí se zřejmými a závažnými projevy vyplývajícími z jasných způsobů přenosu, které umožňují identifikaci kauzativních oblastí genomu. Takové genetické poruchy mají potenciál pro pochopení role specifického lokusu genomu, pokud jej lze identifikovat, protože se často jedná o velké chromozomální oblasti. V případě X-chromozomálních fenotypů očekáváme, že původce bude na X chromozomu, a použijeme různé nové technologie k identifikaci tohoto agens.

V současné době naše omezené znalosti o významu X-chromozomu pro kardiovaskulární patologii pocházejí z jednogenových poruch a více nespecifických rozdílů mezi pohlavími kromě pohlavních chromozomálních anomálií. Naproti tomu nebyla prokázána žádná jednogenová porucha na Y-chromozomu, která by souvisela s kardiovaskulární morbiditou.

K dispozici jsou vhodné lidské modely pro lepší pochopení role, kterou hrají pohlavní chromozomy. Zde se odchylky od normality nejen vyskytují v rozumné prevalenci, ale jsou také spojeny se snadno identifikovatelnými fenotypy a nepříznivou prognózou. Takové modely tvoří Turnerův a Klinefelterův syndrom; ženy s redukcí X-chromozomálního materiálu a muži se zvýšením X-chromozomálního materiálu, resp. Tyto anomálie pohlavních chromozomů jsou spojeny s nadměrnou morbiditou a úmrtností na vrozené i získané kardiovaskulární, stejně jako na diabetes, ovariální insuficienci a další onemocnění.

Kardiovaskulární fenotypy a exprese a aktivace genů jsou zkoumány u zdravých žen a mužů s porovnáním Turnerových a Klinefelterových syndromů v průřezovém deskriptivním designu. Tyto studie již byly provedeny a byla stanovena přesná charakterizace. Hypotézou je, že význam X-chromozomu se projeví jako změněné úrovně exprese a aktivace ve spojení s různými kardiovaskulárními fenotypy. Sekundárně jsou poskytovány základní analogické znalosti o Y-chromozomu. Očekává se, že projekt vytvoří další hypotézy o úloze, kterou hraje genom pro morbiditu jak v populaci s normálním karyotypem, tak v populaci abnormálních karyotypů.

V tomto projektu poskytneme unikátní kombinaci předních molekulárních technologií a dobře definovaných kohort pacientů. Hypotézy, které budeme testovat, jsou následující:

1. Nekódující transkripty z chromozomu X hrají zásadní roli v abnormalitách pohlavních chromozomů a mohou fungovat prostřednictvím regulace epigenetických mechanismů a prostřednictvím destabilizace mRNA.
2. Regulace exprese nekódující RNA na X-chromozomech je založena na epigenetických mechanismech, které vedou k různým histonovým značkám a rozdílné methylaci DNA např. u osob s Turnerovým a Klinefelterovým syndromem ve srovnání se zdravými kontrolami stejného pohlaví.
3. Vzorec genové exprese vyplývající z těchto mechanismů se liší v abnormalitách pohlavních chromozomů ve srovnání se zdravými muži a ženami a tento rozdíl lze studovat v nemocných tkáních žen s Turnerovým syndromem a ve srovnání s normální kontrolní tkání.
4. Může být možné identifikovat jednu nebo několik hnacích molekul v nemocných tkáních osob s Turnerovým a Klinefelterovým syndromem, které mohou být validovány in vitro a in vivo a které mohou vysvětlit procesy onemocnění a poskytnout důležité patofyziologické informace.

Očekávaná zjištění. Očekáváme, že budeme schopni definovat epigenetické změny na X-chromozomech v rozlišení jedné báze, a tak identifikovat CpG metylaci ve vláknech DNA, stejně jako permisivní a represivní histonové značky v histonech.

Očekáváme, že identifikujeme transkriptom jak pro mRNA, tak pro nekódující RNA (dlouhé i mikroRNA) pro RNA generované z X-chromozomu.

Očekáváme, že budeme schopni poskytnout atlas epigenetických událostí specifických pro Turnerovy syndromy a jejich účinků na transkriptom.

S využitím bioinformatických metod to snad povede k identifikaci nových dysregulovaných molekul, které mohou vysvětlit různé vlastnosti těchto pacientů. Tyto molekuly pak budou podrobeny validaci v samostatných kohortách pacientů pomocí technologie PCR nebo IHC.

U nemocné tkáně budeme studovat tkáňově specifické alterace epigenomu a transkriptomu chromozomů X a porovnáme je s normálními tkáněmi z kontrolních vzorků. Doufáme, že to povede k identifikaci hybatelů procesu onemocnění a patofyziologickému pochopení procesu onemocnění.