X-kromosomin inaktivaatio, epigenetiikka ja transkriptio

X-kromosomi on kulmakivi useiden oireyhtymien patogeneesille, joista osa ovat Turnerin oireyhtymä (45,X), Klinefelterin oireyhtymä (47,XXY), kolmois-X-oireyhtymä (47,XXX) ja kaksoisy-oireyhtymä (47,XYY). ). Huolimatta tästä tärkeydestä kliiniselle sairaudelle, vain yksi geeni X-kromosomissa on tähän mennessä ollut osallisena näissä ja muissa X-kromosomissa havaittujen fenotyyppisten piirteiden laajassa spektrissä. Yksi tunnettu geeni on SHOX-geeni (lyhytkasvuinen homeoboxi) ja se koodaa transkriptiotekijää, jolla on aivojen natriureettinen peptidi (BNP) ja fibroblastikasvutekijäreseptorigeeni (FGFR3) transkription kohteina. Se sijaitsee X- ja Y-kromosomien pseudoautosomaalisella alueella. Tämän geenin on osoitettu osallistuvan lyhytkasvuisuuteen Turnerin oireyhtymässä, Leri-Weill-oireyhtymässä ja idiopaattisessa lyhytkasvuisuudessa. Se aiheuttaa myös kasvun kasvua Klinefelterin oireyhtymässä, kolmois-X-oireyhtymässä ja XYY-oireyhtymässä.

X-kromosomaalisissa oireyhtymissä havaitaan usein useita piirteitä ja sairauksia, joita ei voida selittää tällä SHOX-geenillä. Näistä oireyhtymistä parhaiten luonnehditaan Turnerin oireyhtymää, jossa nämä fenotyyppipiirteet voidaan jakaa:

1. Autoimmuunisairaus, joka lisää riskiä lähes kaikkiin autoimmuunisairauksiin, joiden patogeneesi on tuntematon, kuten diabetes ja kilpirauhasen vajaatoiminta.
2. Vähentynyt kohdunsisäinen elinkyky. Tässä on esitetty istukassa toimivien X-kytkettyjen pseudoautosomaalisten geenien haploinsufektiivisyyttä (STS ja CSF2RA).
3. Munasarjojen dysgeneesi, joka johtaa munasarjojen vajaatoimintaan ja pitkäaikaisen sukupuolihormonikorvaushoidon tarpeeseen.
4. Ratkaisemattomien patogeneesien synnynnäiset kardiovaskulaariset epämuodostumat.
5. Aivojen kehitys, erityisesti sosiaalis-kognitiivinen kehitys, joka monissa tapauksissa muuttuu, usein "miesmäisempään" suuntaan.
6. Lisääntynyt metabolisen oireyhtymän ja osteoporoosin esiintyvyys. Terveiden naisten soluissa, joissa on kaksi X-kromosomia, tapahtuu satunnainen X-inaktivaatio (13). Prosessia ohjaa X-inaktivaatiokeskus (XIC) ja sen käynnistää Xist, joka on geeni, joka koodaa pitkää välissä olevaa ei-koodaavaa RNA:ta (lincRNA). Xist-geeni sijaitsee lähellä sentromeeriä X-kromosomin pitkässä käsivarressa, josta se järjestää repressiivisiä histonimodifikaatioita (rekrytoi PRC2) pitkin X-kromosomia, mikä johtaa inaktivoitumiseen. Jäljelle jäävässä aktiivisessa X-kromosomissa PRC2 titrataan pois Tsix:llä, mikä tehokkaasti jättää kaikki naaraat mosaiikeiksi X-kromosomille, joista toinen on äidin ja toinen isän alkuperää. Kuitenkin suuri määrä X-kromosomissa levinneitä geenejä pakenee tätä X-inaktivaatiota tuntemattomilla mekanismeilla ja annoskompensaatio tapahtuu, joten miehen ja naisen välinen ilmentyminen on monien geenien osalta vertailukelpoinen (15, 16). Noin 65 % geeneistä on täysin hiljennetty, kun taas 15 % pakenee kokonaan X-inaktivaatiosta ja 20 %:lla on vaihteleva ilmentyminen kudossolujen alkuperästä riippuen (17).

LincRNA:t transkriptoituvat laajasti genomissa, vaikka niiden roolia terveydessä ja sairauksissa ymmärretään huonosti. Annoskompensaatiota, painamista ja homeoottisten geenien ilmentymistä koskevat tutkimukset viittaavat siihen, että lincRNA:t toimivat DNA:n ja kromatiinin uudelleenmuodostumisen rajapinnassa ja osallistuvat edelleen kromatiinin uudelleenohjelmointiin syövän etäpesäkkeiden edistämiseksi. Tähän mennessä lincRNA:ille on oletettu erilaisia ​​vuorovaikutuksia transkription säätelyssä, ja ne voivat toimia sekä ehjinä vuorovaikutuksessa olevina molekyyleinä että Dicer-prosessoituina molekyyleinä, jotka pilkotaan pieniksi häiritseviksi RNA:iksi, jotka hajottavat muita RNA:ita.

Kromatiinin uudelleenmuotoilua voidaan analysoida histonien DNA-juosteeseen jättämien jälkien perusteella, jotka voivat olla joko permissiivisiä tai repressiivisiä histonien asetylaatiosta tai metylaatiosta riippuen. Esimerkiksi lysiini 4:n trimetylaatio histonissa H3 (H3K4me3) rikastuu transkriptionaalisesti aktiivisissa geenipromoottoreissa, kun taas H3K9:n (H3Kme3) ja H3K27:n (H3K27me3) trimetylaatio on läsnä transkriptionaalisesti repressoituneissa geenipromoottoreissa. Käyttämällä kromatiini-immunosaostusta yhdistettynä syvään sekvensointiin (chIPseq) voidaan saada nämä merkit pitkin koko X-kromosomia yhdessä määrityksessä.

Histonimuunnosten epigeneettisiä muutoksia voidaan tutkia uudella metodologialla, joka mahdollistaa suhteellisen vanhojen patologisten näytteiden käytön. Tämä avaa uusia mahdollisuuksia laajentaa tietämyksemme X-kromosomaalisen permission ja inaktivoinnin roolista eri sairauksissa, jolloin X-kromosomaaliset oireyhtymät voivat toimia lähtökohtana sellaisten prosessien ymmärtämiselle, jotka ovat erittäin todennäköisesti tärkeitä sairauksille (esim. diabetes ja kilpirauhasen vajaatoiminta) näiden oireyhtymien lisäksi. Toisena esimerkkinä sydämen synnynnäiset epämuodostumat ovat yleisiä Turnerin oireyhtymässä ja johtavat usein varhaiseen aortan laajentumiseen ja dissektioon. Näillä potilailla ja kontrolleilla keräämme aortan seinämästä parafiiniin upotettuja kudoslohkoja, jotka voidaan nyt arvioida tällä etulinjan menetelmällä, joka mahdollistaa uusien merkintöjen tunnistamisen Turner-potilaiden DNA:ssa verrattuna muiden kuin Turner-potilaiden DNA:han.

Imprinting on toinen tärkeä näkökohta sukupuolikromosomien toiminnassa. Imprinting viittaa prosessiin, jossa geeni (tai useampia geenejä) voidaan painaa vanhempien alkuperästä riippuen. Toisin sanoen geeni voidaan "kytkeä päälle tai pois päältä" riippuen sen äidin isästä alkuperästä. Lisäksi hiirillä tehdyt tutkimukset osoittavat, että X-kromosomissa oleviin geeniryhmiin on painettu ja ne ovat riippumattomia X-kromosomin inaktivaatiosta.

Biologisen perinnön merkitys on ilmeinen väestön suurissa sydän- ja verisuonisairauksissa, joissa perinnöllinen piirre vallitsee selvästi tietyissä perheissä. Huolimatta lupauksesta kohdistaa sydän- ja verisuonisairauksien ehkäisyyn ja hoitoon, genomin tietyt osat, jotka mahdollisesti laukaisevat patologiat, ovat suurelta osin määrittämättä ja voivat tuoda tärkeää tietoa patofysiologiasta.

Suurin osa genomipoikkeamien vaikutuksista on peräisin sairauksista, joilla on ilmeisiä ja vakavia ilmenemismuotoja, jotka johtuvat selkeistä tartuntatavoista, jotka mahdollistavat genomin aiheuttavien alueiden tunnistamisen. Tällaisilla geneettisillä häiriöillä on mahdollisuus ymmärtää genomin tietyn lokuksen rooli, jos tämä voidaan tunnistaa, koska suuret kromosomialueet ovat usein mukana. X-kromosomaalisten fenotyyppien tapauksessa odotamme aiheuttajan olevan X-kromosomissa ja käytämme erilaisia ​​uusia tekniikoita tämän tekijän tunnistamiseen.

Tällä hetkellä rajallinen tietomme X-kromosomin merkityksestä sydän- ja verisuonipatologialle tulee yhden geenin häiriöistä ja sukupuolikromosomaalisten poikkeavuuksien lisäksi epäspesifisemmistä sukupuolieroista. Sitä vastoin yhden geenin Y-kromosomissa ei ole osoitettu liittyvän sydän- ja verisuonisairauksiin.

Asianmukaisia ​​ihmismalleja sukupuolikromosomien roolin ymmärtämiseksi on saatavilla. Tässä poikkeamia normaalista ei vain tapahdu kohtuullisella esiintyvyydellä, vaan ne liittyvät myös helposti tunnistettavissa oleviin fenotyyppeihin ja haitallisiin ennusteisiin. Turnerin ja Klinefelterin oireyhtymät muodostavat tällaisia ​​malleja; naarailla X-kromosomimateriaalin väheneminen ja miehillä X-kromosomaalisen materiaalin lisääntymisellä, vastaavasti. Nämä sukupuolikromosomien poikkeavuudet liittyvät sekä synnynnäisiin että hankittuihin sydän- ja verisuonisairauksiin sekä diabetekseen, munasarjojen vajaatoimintaan ja muihin sairauksiin.

Kardiovaskulaarisia fenotyyppejä sekä geenien ilmentymistä ja aktivaatiota tutkitaan terveillä naisilla ja miehillä vertaamalla Turnerin ja Klinefelterin oireyhtymiä poikkileikkauskuvaussuunnitelmassa. Nämä tutkimukset on jo tehty ja tarkka luonnehdinta on laadittu. Oletuksena on, että X-kromosomin merkitys ilmenee muuttuneina ilmentymistasoina ja aktivaatioina erilaisten kardiovaskulaaristen fenotyyppien yhteydessä. Toissijaisesti tarjotaan analogista perustietoa Y-kromosomista. Projektin odotetaan synnyttävän lisää hypoteeseja genomin roolista sairastuvuuden kannalta sekä populaatiossa, jolla on normaali karyotyyppi, että epänormaaleissa karyotyypeissä.

Tässä projektissa tarjoamme ainutlaatuisen yhdistelmän etulinjan molekyylitekniikoita ja hyvin määriteltyjä potilasryhmiä. Hypoteesit, joita testaamme, ovat seuraavat:

1. X-kromosomista peräisin olevilla ei-koodaavilla transkripteilla on perustavanlaatuinen rooli sukupuolikromosomien poikkeavuuksissa, ja ne voivat toimia epigeneettisten mekanismien säätelyn ja mRNA:n destabiloinnin kautta.
2. Ei-koodaavan RNA:n ilmentymisen säätely X-kromosomeissa perustuu epigeneettisiin mekanismeihin, jotka johtavat erilaisiin histonimerkkeihin ja erilaiseen DNA:n metylaatioon esim. Turnerin ja Klinefelterin oireyhtymäpotilailla verrattuna terveisiin sukupuoliyhteensopiviin kontrolleihin.
3. Näistä mekanismeista johtuva geenin ilmentymiskuvio on erilainen sukupuolikromosomipoikkeavuuksissa verrattuna terveisiin miehiin ja naisiin, ja tätä eroa voidaan tutkia Turnerin syndroomaa sairastavien naisten sairaissa kudoksissa ja verrata normaaliin kontrollikudokseen.
4. Turnerin ja Klinefelterin oireyhtymän henkilöiden sairaissa kudoksissa voi olla mahdollista tunnistaa yksi tai muutama kuljettajamolekyyli, jotka voidaan validoida in vitro ja in vivo ja jotka voivat selittää sairauden prosesseja ja antaa tärkeitä patofysiologisia tietoja.

Odotetut löydöt. Odotamme pystyvämme määrittelemään epigeneettiset muutokset X-kromosomeissa yhdellä emäsresoluutiolla, mikä tunnistaa CpG-metylaation DNA-säikeissä sekä sallivat ja repressiiviset histonimerkit histoneissa.

Odotamme tunnistavan transkription sekä mRNA:sta että ei-koodaavista RNA:ista (pitkät sekä mikroRNA:t) X-kromosomista tuotetuille RNA:ille.

Odotamme pystyvämme tarjoamaan Atlasin Turnerin oireyhtymäkohtaisista epigeneettisistä tapahtumista ja niiden vaikutuksista transkriptiin.

Bioinformaattisia menetelmiä käyttämällä tämä toivottavasti johtaa uusien, säätelemättömien molekyylien tunnistamiseen, jotka voivat selittää näiden potilaiden erilaisia ​​ominaisuuksia. Nämä molekyylit validoidaan sitten erillisissä potilasryhmissä käyttämällä PCR- tai IHC-tekniikkaa.

Sairaassa kudoksessa tutkimme X-kromosomien epigenomin ja transkription kudosspesifisiä muutoksia ja verrataan näitä normaaleihin kudoksiin kontrollinäytteistä. Toivomme, että tämä johtaa taudin aiheuttajien tunnistamiseen ja sairausprosessin patofysiologiseen ymmärtämiseen.