Wolumetria i proteomika w przetokowym wodogłowiu normalnym ciśnieniem (LiNPH)

TŁO I PODSUMOWANIE OPIS PROJEKTU

Idiopatyczne wodogłowie prawidłowego ciśnienia (=iNPH) to stan z zaburzoną dynamiką mózgową, powodujący objawy w postaci zaburzeń równowagi i chodu, nietrzymania moczu oraz upośledzenia funkcji poznawczych u pacjentów z rozstrzeniem komór mózgu. Schorzenie to występuje znacznie częściej niż powszechnie wiadomo, a częstość jego występowania gwałtownie wzrasta wraz z wiekiem, od 2,1% w wieku 70 lat do 8,9% w wieku powyżej 80 lat. Adams i Hakim opisali chorobę już w 1965 roku na podstawie symptomatologii i odwracalności objawów po nakłuciu płynu mózgowo-rdzeniowego. Jednak dopiero w 2005 roku ukazała się kompilacja opartych na dowodach wytycznych dotyczących diagnozowania i leczenia choroby, Międzynarodowych Wytycznych iNPH. Stwierdzono, że obecnie oprócz testu nakłucia płynu mózgowo-rdzeniowego nie ma wiarygodnego testu predykcyjnego dla prawdopodobieństwa odpowiedzi pacjenta na przetoczenie. Istnieje kilka różnych skal do oceny ciężkości choroby, z których jedną jest skala iNPH, z podskalami chodu, równowagi, neuropsychologii i wstrzemięźliwości.

Na Oddziale Neurochirurgii (NK) i Neurologii (NL) Szpitala Uniwersyteckiego w Linköping od 2004 roku istnieje dobrze funkcjonujący wielospecjalistyczny zespół. Zespół bada i leczy iNPH ze skierowaniami pochodzącymi z południowo-wschodniego regionu opieki zdrowotnej w Szwecji. Rocznie otrzymuje się około 250 skierowań, ocenia się 70-80 pacjentów, a co najmniej 40 pacjentów operuje się z przetoką komorowo-otrzewnową. Ocena obejmuje pierwszy etap badań radiologicznych, ocenę kliniczną przeprowadzaną przez neurologa, następnie ocenę ruchową przeprowadzaną przez fizjoterapeutę oraz ocenę funkcji poznawczych przeprowadzaną przez terapeutę zajęciowego. Zwykle wykonuje się badanie CSF, polegające na pobraniu do 50 ml płynu mózgowo-rdzeniowego przez nakłucie lędźwiowe, co w iNPH zwykle łagodzi objawy. Ocena obejmuje również nagranie wideo wzorca ruchu oceny jakościowej. Wyniki wraz z radiologią są ważone razem, a następnie zespół, jeśli pacjentowi należy zaproponować leczenie. Chorych operuje się z przetoką komorowo-otrzewnową w NK i kontroluje się w NL tymi samymi testami motorycznymi i poznawczymi po trzech miesiącach od operacji, po czym ocenia się wyniki. W większych badaniach około 70% pacjentów z iNPH otrzymujących zastawkę poprawia się po operacji.

Terapia zastawkowa jest jedyną metodą leczenia iNPH i jest dostępna od lat pięćdziesiątych XX wieku. Celem leczenia jest zmniejszenie ilości płynu mózgowo-rdzeniowego w układzie komorowym i tym samym normalizacja objętości w układzie komorowym. Od początku lat 90. coraz częściej stosuje się regulowane zawory bocznikowe. Oznacza to, że zastawkę można w razie potrzeby wyregulować po wszczepieniu za pomocą zewnętrznego magnesu przyłożonego do miejsca zastawki. Wadą większości regulowanych zaworów jest to, że ustawienie zaworu można przypadkowo wyregulować w przypadku wystawienia na działanie silnych pól magnetycznych, na przykład gdy pacjent jest poddawany badaniu za pomocą kamery magnetycznej. Regulowane zawory mają jednak wiele zalet, ponieważ opór można dostosować do potrzeb pacjenta nawet po operacji. Na przykład jedno z najczęstszych powikłań po przetoczeniu (krwiak podtwardówkowy) często można leczyć poprzez zwiększenie oporu zastawki. W 2015 roku firma Codman Johnson & Johnson wprowadziła nowy zawór bocznikowy Certas Plus, który jest regulowanym bocznikiem z ośmioma różnymi ustawieniami. Zastawka jest stosowana w praktyce klinicznej. Szczególną cechą jest najwyższe ustawienie (8), które wynosi 40 cm H20, co jest bardzo wysoką rezystancją, która w teorii powinna być równoważna z wyłączonym bocznikiem i jest nazywana przez firmę „virtual off”. Został również zaprojektowany tak, aby był odporny na rezonans magnetyczny, a zatem nie zmienia ustawień po wystawieniu na działanie pola magnetycznego MRI. Te cechy były dotychczas testowane in vitro, ale nie przeprowadzono jeszcze żadnych badań klinicznych. Zaletą tych funkcji jest potencjalnie mniej zabiegów chirurgicznych i opieki szpitalnej, a także umożliwienie pacjentom z południowo-wschodniego regionu opieki zdrowotnej przeprowadzanie planowych i ostrych badań MRI w ich macierzystym szpitalu bez konieczności udawania się na oddział neurochirurgii w Linköping w celu ponownej regulacji zastawek.

Rozstrzenie komór jest rozpoznaniem radiologicznym. Od lat czterdziestych XX wieku mierzono największą średnicę między bocznymi granicami komór bocznych i największą średnicę dwuciemieniową po wewnętrznej stronie czaszki, aby uzyskać tak zwany wskaźnik Evansa poprzez podzielenie tych dwóch i uzyskanie stosunku. Jest łatwa do zmierzenia, ale jest metodą obarczoną wieloma źródłami błędów i małą wrażliwością na zmiany objętości w układzie komorowym. Istnieje potrzeba bardziej niezawodnej metody zarówno w praktyce klinicznej, jak iw badaniach. Wolumetria, czyli pomiar objętości komór, jest coraz częściej stosowaną metodą, która jednak nie znalazła jeszcze zastosowania w praktyce klinicznej ze względu na czasochłonne ręczne obliczenia. Dzięki obrazom MRI, które są konwertowane w specjalnym oprogramowaniu (ITK-SNAP), można obliczyć objętość i sporządzić trójwymiarowy obraz układu komorowego. W kilku badaniach w piśmiennictwie zbadano zależność między oporem zastawek bocznikowych a zmniejszeniem objętości komór. Nie ma prospektywnych, zaślepionych badań oceniających zmianę objętości komorowej związaną z terapią przetoki, opornością na przetokę, ani też nie ma badań dotyczących korelacji między zmniejszeniem objętości komorowej a pooperacyjnym wynikiem klinicznym. Grupa badawcza z Uppsali niedawno opublikowała badanie dotyczące pacjentów z przetoką iNPH, w których nowa technologia MRI opracowana w Linköping (SyntheticMR) wyraźnie pokazuje, jak zmniejsza się objętość komór po leczeniu bez zmiany wskaźnika Evansa. W tym samym badaniu udało się również pokazać, jak po przetoczeniu wyraźnie zmienia się inny parametr w komorach, tzw. kąt modzelowaty. Jest to część skali oceny radiologicznej, Radscale, którą można zastosować w tej grupie pacjentów. Ta sama grupa badawcza była już wcześniej w stanie wykazać za pomocą SyntheticMR, w jaki sposób objętość komór zmniejsza się po testach nakłuć u pacjentów z iNPH, aby przywrócić pierwotną wartość w ciągu 24 godzin. CMIV (=Centrum Obrazowania i Wizualizacji Medycznej) w US Linköping posiada kilka aparatów MR 3-Teslowych Szpitala Uniwersyteckiego oraz dobrą wiedzę technologiczną i naukową na temat Syntetycznego MR w miarę opracowywania tej metody. Za pomocą krótkiego protokołu MRI (6 minut) generuje dane ilościowe o stanie tkanki mózgowej, co ułatwia stwierdzenie, czym jest istota szara i biała mózgu, białko podporowe komórek mózgowych mielina oraz płyn mózgowo-rdzeniowy i oblicza objętość każdego składnika. Sekwencje ze standardowymi protokołami dla wodogłowia, w tym sekwencje DTI (=Diffusion Tenzor Imaging), wymagają dodatkowych 15-20 minut w aparacie MRI. Syntetyczny MR może również jako jedyna dotychczas metoda łatwo obliczyć objętość płynu mózgowo-rdzeniowego znajdującego się poza komorami w zbiornikach podstawnych i bruzdach mózgowych. Jednak nikt do tej pory nie badał objętości pozamózgowego płynu mózgowo-rdzeniowego w zdrowym mózgu lub w iNPH. Ponadto nikt nie badał, jak zmienia się ta objętość pozamózgowego płynu mózgowo-rdzeniowego w odpowiedzi na przetaczanie.

Proteom to zbiorcza nazwa białek syntetyzowanych przez organizm lub narząd. Proteom nie jest stały, ale zmienia się w różnych narządach w tym samym organizmie iw tym samym narządzie w czasie i zmienia się w chorym organizmie lub narządzie. Proteomika to nauka zajmująca się tymi białkami i może być wykorzystywana do badania, kiedy i gdzie można znaleźć określone białka, ich stężenia, sposobu ich rozkładu, modyfikacji i interakcji w różnych procesach fizjologicznych i chorobowych. Członkowie naszej grupy badawczej scharakteryzowali zmiany proteomiczne niektórych chorób neurologicznych, takich jak drżenie samoistne i przewlekły ból neuropatyczny. Proteomika płynu mózgowo-rdzeniowego u pacjentów z iNPH jest stosunkowo niezbadana, a jedynie trzy badania w literaturze. Scharakteryzowały one kilka białek, które wyróżniają się na tle tego, czego oczekuje się od zdrowego mózgu. Nie przeprowadzono badań porównawczych płynu mózgowo-rdzeniowego pobranego przez nakłucie lędźwiowe z płynem mózgowo-rdzeniowym z komór. Na Oddziale Medycyny Bólu i Rehabilitacji Szpitala Uniwersyteckiego w Linköping powstaje laboratorium proteomiki (PAINOMICS lab) z wieloma publikacjami naukowymi. Standardowymi metodami dostępnymi w badaniach proteomicznych są dwuwymiarowa elektroforeza żelowa (elektroforeza 2D) oraz spektrometria mas (LC-MS/MS). Stosuje się je do analizy do tysiąca białek w jednej próbce i za pomocą technologii opartej na przeciwciałach dokonuje się ich walidacji. Dzięki technologii opartej na przeciwciałach można również analizować do 86 cytokin, chemokin, czynników wzrostu i substancji metabolicznych w tzw. panelu multipleksowym. Zbiory danych uzyskiwane w badaniach proteomicznych są złożone. Te zbiory danych składają się z wielu wysoce skorelowanych zmiennych (stężeń białek). Następnie można porównać zmiany zawartości białek między pacjentami z iNPH i grupą kontrolną, ustalając różnicę w „odcisku palca” proteomu. Istnieje duże zapotrzebowanie na nowe biomarkery jako uzupełnienie obecnie dostępnych metod stawiania jednoznacznej diagnozy, oceny prawdopodobieństwa powodzenia terapii i głębszego zrozumienia patofizjologii iNPH.

CELE, ZAGADNIENIA NAUKOWE I PRZEDMIOTY:

1. Oceń i zatwierdź użyteczną klinicznie metodę monitorowania objętości komór za pomocą syntetycznego rezonansu magnetycznego. Porównanie z ustaloną metodą wolumetryczną (ITK-SNAP) oraz rzetelność wewnątrz- i między oceniającymi.
2. Mapuj objętości komór i ilość pozamózgowego wewnątrzczaszkowego płynu mózgowo-rdzeniowego w normalnych warunkach fizjologicznych u zdrowych osób kontrolnych i pacjentów z INPH i oblicz, jak te objętości zmieniają się po przetoczeniu w INPH.
3. Zbadaj, jak zmiana objętości i zmiana wolumetrii oraz iNPH Radscale po przetoczeniu korelują z wynikami klinicznymi 3 miesiące po operacji.
4. Zbadaj zastawkę bocznikową CERTAS PLUS pod kątem jej działania i bezpieczeństwa pod kątem odporności na rezonans magnetyczny in vivo i skoreluj stopień zmniejszenia objętości komór w oparciu o opór zastawki.
5. Zmapuj ekspresję proteomiczną iNPH w płynie mózgowo-rdzeniowym i osoczu krwi przed operacją i monitoruj zmiany po 3, 12 i 36 miesiącach od przetoki komorowo-otrzewnowej.
6. Porównaj, w jaki sposób proteomika płynu mózgowo-rdzeniowego w iNPH różni się między lędźwiowym i komorowym płynem mózgowo-rdzeniowym oraz osoczem krwi. Zbadaj, czy CSF lędźwiowego odcinka lędźwiowego pacjentów z iNPH różni się od neurologicznie zdrowej kohorty kontrolnej osób w podobnym wieku i pacjentów z drżeniem samoistnym.

PLAN PROJEKTU, REALIZACJA I WYBÓR OBIEKTÓW BADAWCZYCH:

Szwedzka Krajowa Rada ds. Przeglądu Etyki (Etikprövningsmyndigheten), nr ref. 2020-0071920, zatwierdziła ten plan projektu.

Pięćdziesięciu pacjentów, którzy przeszli badanie zespołu NPH i którzy zostali uznani za odpowiednich do leczenia zastawki, jest kolejno rekrutowanych do badania.

Grupa kontrolna składająca się z 50 ochotników w wieku powyżej 60 lat jest rekrutowana z listy oczekujących na operację oddziałów ortopedii, urologii i ginekologii Szpitala Uniwersyteckiego w Linköping. Ochotnicy będą rekrutowani spośród starszych pacjentów, którzy podczas planowego zabiegu ortopedycznego/ginekologicznego/urologicznego w znieczuleniu dolędźwiowym zostaną poddani nakłuciu lędźwiowemu w celu podania znieczulenia. Ochotnicy przejdą przed operacją badanie MRI obejmujące standardowe sekwencje oraz protokoły SyntheticMR do wolumetrii.

Badanie przedoperacyjne zespołu NPH pacjentów z iNPH obejmuje następujące badania: 1. Ocena kliniczna przeprowadzana przez neurologa. 2. Równowagę i zdolność chodzenia ocenia fizjoterapeuta. Testy obejmują Timed Up and Go (TUG), liczbę kroków i czas, a także skalę chodu, skalę równowagi i 10-metrowy marsz w ramach skali iNPH. 3. Terapeuta zajęciowy ocenia funkcje poznawcze i wykonuje następujące testy: MMSE (=Mini-Mental State Examination), Tablica z rowkami, Test uczenia się słownego Reya, nazywanie kolorów Stroopa i interferencja Stroopa, Test tworzenia śladów A i B. 4. Ocena nietrzymanie moczu wykonuje się na skali nietrzymania moczu. Wszystkie oceny są łączone w skali iNPH.

W zakres badania podstawowego wchodzi nakłucie lędźwiowe z pomiarem ciśnienia wewnątrzkanałowego, analiza komórek, białka, przeciwciał przeciwko boreliozie oraz test nakłucia płynu mózgowo-rdzeniowego. Historia medyczna pacjenta, objawy i wyniki radiologii i testu nakłucia płynu mózgowo-rdzeniowego są omawiane w zespole NPH w celu podjęcia decyzji, czy pacjent kwalifikuje się do przetoki.

Pacjenci, którym zespół zarekomendował przetoczenie i nie spełniają kryteriów wykluczenia z badania, są wzywani na wizytę ambulatoryjną do dr Rafaela Holmgrena, informowani o planowanej operacji i związanym z nią ryzyku oraz proponowani udziału w badaniu po ustnej i pisemnej informacji. Pacjenci mają czas na przemyślenie i powrót do telefonu pielęgniarki kontaktowej przed odebraniem.

Ochotnicy z grupy kontrolnej są rekrutowani spośród pacjentów planowanych do operacji w znieczuleniu podpajęczynówkowym przez oddziały Ortopedii, Urologii i Ginekologii Szpitala Uniwersyteckiego w Linköping. O ewentualnym udziale w badaniu są informowani ustnie telefonicznie lub na życzenie podczas konsultacji ambulatoryjnej z dr Rafaelem Holmgrenem, oprócz informacji pisemnej. Uczestnicy grupy kontrolnej przed operacją zostaną poddani badaniu MRI ze standardowym protokołem i syntetycznym MRI. Przed podaniem znieczulenia podpajęczynówkowego pobiera się 10 ml płynu mózgowo-rdzeniowego z odcinka lędźwiowego do analizy profilu proteomicznego oraz pobiera się w tym samym celu próbkę krwi.

Uczestniczący pacjenci z iNPH, którzy mają zostać przetoczeni, zostaną poddani badaniu MRI ze zmodyfikowanym standardowym protokołem i syntetycznym rezonansem magnetycznym w przeddzień operacji; wymagany czas to około 45 minut.

Następnego dnia pacjenci poddawani są znieczuleniu ogólnemu i wykonuje się nakłucie lędźwiowe, po czym pobiera się 10 ml płynu mózgowo-rdzeniowego. Jednocześnie pobierana jest również próbka krwi do analizy proteomicznej. Pacjent jest operowany z przetoką komorowo-otrzewnową zgodnie ze standardową procedurą przez jednego z trzech chirurgów (dr Rafael Holmgren, dr Peter Zsigmond lub dr Martin Nilsson z NK). Pacjenci otrzymują zastawkę bocznikową Codman CERTAS PLUS z jednym z dwóch ustawień zastawki ukrytych dla operatora, pacjenta i badaczy radiologicznych (ustawionych przez innego współpracownika zgodnie z randomizacją): 4 (=110 mm H20 , konwencjonalne ustawienie domyślne) lub 8 (> 400 mm H20, czyli „wirtualne wyłączenie”). Ponieważ komory mózgowe są nakłuwane przez cewnik, pobiera się tutaj kolejne 10 ml płynu mózgowo-rdzeniowego do badań proteomicznych. Próbki są transportowane do laboratorium proteomiki, odwirowywane, dzielone na małe porcje przed zamrożeniem. Następnie są one przechowywane w biobanku Oddziału Medycyny Pracy i Środowiskowej Szpitala Uniwersyteckiego w Linköping (zarejestrowanego w Krajowej Radzie ds. Zdrowia i Opieki Społecznej). Każdemu zgłaszającemu się pacjentowi nadawany jest niepowtarzalny numer kodowy i tym numerem oznaczane są wszystkie probówki. Klucz kodowy jest przechowywany w zamkniętej szafce na Oddziale Neurochirurgii w Linköping.

Po około 36 godzinach (zakres 24-48 godzin) po operacji pacjent przechodzi ponowne badanie MRI aparatem SyntheticMR, po którym sprawdza się ustawienie zastawki za pomocą czytnika kompasu trzymanego nad zastawką. Pacjenci, którzy początkowo otrzymywali ustawienie zastawki 8, są teraz dostosowywani do standardowego ustawienia 4, chyba że po operacji wystąpił u nich krwiak podtwardówkowy, który jest wykrywany w badaniu MRI po operacji. Następnie pacjent jest wypisywany do domu lub lokalnego szpitala. W ten sposób wszyscy pacjenci wracają do domu z funkcjonującym leczeniem zastawkowym.

Po 3 miesiącach pacjenci są wzywani na standardową obserwację pacjentów z przetokowanym iNPH w celu ponownej wizyty u chirurga i przeprowadzenia badania klinicznego/kontroli przez fizjoterapeutę i terapeutę zajęciowego z tym samym protokołem badań ruchowych i poznawczych jak przed operacją. Pacjenci przechodzą również nowe badanie MRI z takim samym protokołem jak przed operacją. Ustawienie zaworu bocznikowego jest sprawdzane po badaniu MRI, aby potwierdzić, że ustawienie zaworu jest takie samo jak poprzednio. Komorę zastawki przebija się również w sterylnych warunkach małą igłą w celu uzyskania 10 ml płynu mózgowo-rdzeniowego z komór i pobiera się również próbkę krwi do analizy proteomicznej.

Pacjenci są ponownie wzywani do lekarza operującego rok i trzy lata po operacji w celu oceny klinicznej i ponownego nakłucia zastawki oraz badań krwi z zachowaniem takiego samego postępowania jak przy kontroli 3-miesięcznej.

Wszystkie powikłania związane z przetoką, w tym korekty rezystancji przetoki w związku z MRI, są rejestrowane w sposób ciągły.

Testy próbek płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi są wykonywane przez profesora Bijara Ghafouri w laboratorium Painomics przy użyciu zarówno spektrometrii mas, jak i elektroforezy 2D w celu identyfikacji, rozdzielenia białek i technik ELISA w celu ich scharakteryzowania. Tożsamość próbki jest zaślepiona dla egzaminatora.

Badania MRI są analizowane w specjalnym oprogramowaniu przystosowanym do oceny objętości w badaniach wykonanych zarówno przy użyciu technologii konwencjonalnej (ITK SNAP), jak i technologii SyntheticMR przez dr Holmgrena i dr Georgiopoulosa. Tożsamość pacjenta i ustawienie bocznika są ślepe dla egzaminatorów, a także czasu badania.

STATYSTYCZNE PODSTAWY WIELKOŚCI BADANEJ POPULACJI

Uznaje się, że liczba pięćdziesięciu pacjentów z iNPH jest wystarczająca, aby spełnić określone cele projektu. Dzieje się tak, ponieważ badania proteomiki w iNPH (przez Chen i wsp. oraz Li i wsp., patrz odnośniki) obejmowały odpowiednio 18 i 15 pacjentów i uzyskały wyraźne statystycznie istotne wyniki. Badania objętości komór obliczone za pomocą syntetycznego MRI po nakłuciu lędźwiowym i przetoce przeprowadzone przez Virhammara i wsp. obejmowały odpowiednio 23 i 18 pacjentów i dały wyraźne statystycznie istotne wyniki. Liczba neurologicznie zdrowych osobników kontrolnych/ochotników w grupie kontrolnej wynosi 50, co odpowiada liczbie pacjentów z INPH.