Sygnatury inwazji naczyniowej w cfDNA wspierają zmianę stopnia zaawansowania raka wątroby

Projekt badania:

Wykryto profile genetyczne związane z MVI we wczesnym stadium HCC w celu wygenerowania panelu genów w oparciu o dane WES i docelowego genu NGS sparowanych tkanek nowotworowych i nienowotworowych. Następnie zidentyfikowano zmiany genomowe związane z MVI w przedoperacyjnym cfDNA za pomocą ukierunkowanego sekwencjonowania z panelem. W oparciu o sygnatury genomowe w cfDNA skonstruowano model nomogramu do przewidywania ryzyka MVI przed operacją, a następnie opracowano paradygmat zmiany stopnia zaawansowania dla wczesnego stadium HCC w oparciu o przewidywane wysokie lub niskie ryzyko MVI na podstawie nomogramu. Ponadto zbadano kliniczne znaczenie systemu przywracania stopnia zaawansowania w podejmowaniu decyzji o optymalnym zakresie resekcji chirurgicznej HCC. Badanie to zostało zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyczną każdego ośrodka, a od wszystkich pacjentów uzyskano świadomą zgodę na wykorzystanie ich tkanek lub próbek krwi oraz danych klinicznych do celów badawczych.

Pacjenci, leczenie chirurgiczne i obserwacja:

Kryteriami kwalifikującymi byli pacjenci w wieku 18-75 lat, histopatologicznie potwierdzony HCC, guz spełniający kryteria mediolańskie, klasa A czynności wątroby wg klasyfikacji Childa-Pugha, brak wywiadu w kierunku innych nowotworów złośliwych, brak wcześniejszego leczenia przeciwnowotworowego, w tym terapii neoadjuwantowej przed operacją, wyleczenie- celowa resekcja chirurgiczna zdefiniowana jako całkowite usunięcie makroskopowych guzków z mikroskopijnymi marginesami resekcji bez guza i bez odległych przerzutów i dużej inwazji naczyń oraz pełne dane kliniczno-patologiczne i kontrolne.

Prospektywnie zebrano łącznie 436 pacjentów, którzy przeszli chirurgiczną resekcję z powodu wczesnego stadium HCC między czerwcem 2015 a grudniem 2017 roku i spełniali kryteria kwalifikacji. Spośród tych pacjentów 150 pacjentów, którzy byli operowani między czerwcem 2015 a majem 2016 we wschodnim szpitalu chirurgii wątroby i dróg żółciowych (EHBH), służyło jako kohorta odkrywająca panel. Sparowany guz i sąsiednie tkanki nienowotworowe od 81 pacjentów wykorzystano do WES, a te od kolejnych 69 pacjentów do ukierunkowanego genu NGS przy użyciu komercyjnego panelu 123 genów do wykrywania mutacji związanych z MVI.

Do badania cfDNA wykorzystano kolejnych 286 pacjentów, którzy przeszli operację między czerwcem 2016 a grudniem 2017 w ośrodkach wieloośrodkowych. Próbki krwi obwodowej tych pacjentów pobrano 30 minut przed operacją w celu ekstrakcji cfDNA. Oprócz konwencjonalnej oceny przedoperacyjnej przeprowadzono ocenę objętościową przyszłej pozostałości wątroby (FLR) przy użyciu trójwymiarowej rekonstrukcji badań obrazowych. Wszystkie resekcje wykonano z zamiarem całkowitego usunięcia guzka(ów) guza poprzez resekcję anatomiczną lub nieanatomiczną. Szerokość marginesu resekcji chirurgicznej została ostatecznie ustalona przez chirurgów operujących na podstawie wielkości guza, liczby guzów, lokalizacji wewnątrzwątrobowej, miejscowych inwazyjnych cech guza w badaniach obrazowych, marskości wątroby, szacowanej objętości FLR, czynności wątroby i ogólnego stanu pacjentów zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami , a także na doświadczeniu chirurga jako studium praktyki w świecie rzeczywistym. Pacjenci byli regularnie kontrolowani po operacji. Nawrót/przerzuty guza zdefiniowano jako pojawienie się nowych zmian chorobowych potwierdzonych co najmniej dwiema technikami obrazowania radiologicznego, z podwyższeniem lub bez podwyższenia poziomu markerów nowotworowych w surowicy.

Spośród tych 286 pacjentów, 125 z EHBH stanowiło kohortę szkoleniową do identyfikacji cech genomowych związanych z MVI w cfDNA i opracowania modelu przewidywania MVI, podczas gdy pozostałych 161 pacjentów z wielu ośrodków (Szpital Zhongda z Southeast University, Nanjing; Sun Yat -Sen Memory Hospital of Sun Yat-Sun University, Guangzhou; Mengchao Hepatobiliary Surgery Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou; i EHBH, Szanghaj) służyły jako zewnętrzna kohorta walidacyjna do weryfikacji wydajności modelu.

Przedoperacyjne zmienne kliniczne:

Zarówno sygnatury genomowe związane z MVI w cfDNA, jak i przedoperacyjne zmienne kliniczne, które prawdopodobnie były związane z MVI, zostały wykorzystane do identyfikacji niezależnych czynników ryzyka MVI w celu opracowania modelu przewidywania MVI. Przedoperacyjne zmienne kliniczne obejmowały wiek, płeć, bilirubinę całkowitą (TBIL), aminotransferazę alaninową (ALT), aminotransferazę asparaginianową (AST), albuminę, płytki krwi, czas protrombinowy (PT), α-fetoproteinę (AFP), protrombinę wywołaną brakiem witaminy K -II (PIVKA-II), serologia wirusowego zapalenia wątroby typu B i C, poziom HBV-DNA oraz cechy obrazowe, takie jak liczba guza, średnica guza i marskość wątroby w przedoperacyjnym tomografii komputerowej ze wzmocnieniem kontrastowym i/lub obrazowaniu metodą rezonansu magnetycznego (MRI).

Rozpoznanie histopatologiczne MVI:

Wycięte chirurgicznie preparaty były rutynowo badane histopatologicznie po operacji. Aby zapewnić jakość próbek tkanek w wykrywaniu MVI, zastosowano protokół pobierania próbek z siedmiu miejsc zalecany przez Oddział Patologii Chińskiego Towarzystwa Medycznego (CMS). Skrawki tkanki nowotworowej i nienowotworowej wątroby badano w celu zaobserwowania obecności MVI. Rozpoznanie histopatologiczne MVI było zgodne z wcześniejszymi doniesieniami. W skrócie, MVI identyfikowano, jeśli w małych odgałęzieniach żyły wrotnej lub żyle wątrobowej w sąsiednich tkankach wątroby lub w dużych naczyniach torebkowych wyłożonych śródbłonkiem znajdował się zator nowotworowy lub gniazdo komórek nowotworowych, które były widoczne tylko pod mikroskopem. W każdym ośrodku zastosowano te same kryteria histopatologicznego rozpoznania MVI. Szerokość marginesu resekcji chirurgicznej zdefiniowano jako najbliższą odległość między surową powierzchnią po resekcji wątroby a torebką guza. Wszystkie badania histopatologiczne zostały przeprowadzone niezależnie przez trzech patologów, którzy doszli do konsensusu w drodze dyskusji, jeśli istniały jakiekolwiek kontrowersje.

Ocena przydatności do resekcji z szerokim i wąskim marginesem Spośród 286 pacjentów pacjentów, którzy przeszli resekcję z wąskim marginesem, poddano ponownej ocenie pooperacyjnej w celu ustalenia, czy kwalifikują się również do resekcji z szerokim marginesem. Trzej starsi chirurdzy wątrobowi, którzy byli ślepi na informacje prognostyczne, dokonali przeglądu danych przedoperacyjnych tych pacjentów. Na podstawie cech obrazowania, w tym wielkości guza, liczby guzów, statusu torebki guza, lokalizacji guza wewnątrzwątrobowego, szacowanej objętości FLR4, stopnia marskości wątroby, czynności wątroby, ogólnej sprawności, a także własnego doświadczenia chirurgicznego. Ocenę oparto na technicznej wykonalności i bezpieczeństwie chirurgicznym.

Próbki tkanek i krwi:

Świeże próbki tkanek pobrano i przechowywano w temperaturze -80 ℃ do czasu użycia. Krew obwodową (10 ml na próbkę) zebrano do probówek Vacutainer z EDTA w ciągu 30 minut przed operacją, przetworzono w ciągu 1 godziny od pobrania i rozdzielono przez wirowanie przy 1600 g przez 10 minut, przeniesiono do probówek do mikrowirówki i odwirowano przy 20 000 g przez 10 minut. minut, aby usunąć resztki komórek. Zebrano zarówno osocze, jak i krwinki białe i przechowywano je w temperaturze -80°C do czasu użycia.

Ekstrakcja genomowego DNA i cfDNA:

Genomowy DNA z tkanek nowotworowych i leukocytów ekstrahowano za pomocą zestawu DNeasy Tissue lub Blood Kit (Qiagen), a następnie fragmentowano do wielkości w zakresie od 200 do 400 bp przy użyciu Covaris S2 SonoLAB (Covaris). cfDNA wyizolowano z 3-5 ml osocza każdego pacjenta przy użyciu zestawu QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen). DNA ekstrahowano zgodnie z instrukcją producenta, oceniano ilościowo za pomocą fluorometru Qubit (Life Technologies) i trzymano w temperaturze -80 ℃ aż do użycia.

Sekwencjonowanie całego egzomu:

Jako materiał wejściowy do przygotowania biblioteki DNA użyto 1 μg DNA na próbkę. Bibliotekę sekwencjonowania wygenerowano przy użyciu SureSelect XT Target Enrichment System for Illumina Paired-End Sequencing Library (Agilent), a do każdej próbki dodano kody indeksowe. Próbki genomowego DNA fragmentowano przez sonikację do średniej wielkości ~ 400 bp. Fragmenty DNA wypolerowano na końcach, ogoniano i zligowano z adapterem pełnej długości do sekwencjonowania, po czym przeprowadzono amplifikację PCR. Biblioteki analizowano pod kątem rozkładu wielkości przy użyciu Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent). Grupowanie próbek z kodem indeksowym przeprowadzono przy użyciu systemu generowania klastrów cBot (Illumina) zgodnie z instrukcją producenta. Po wygenerowaniu klastra biblioteki DNA zsekwencjonowano na platformie Illumina HiSeq 2000 i wygenerowano sparowane odczyty sekwencjonowania multipleksowego 2 × 100 nt.

Ukierunkowane sekwencjonowanie genu nowej generacji:

W ukierunkowanym sekwencjonowaniu tkanek HCC za pomocą komercyjnego panelu 123 genów, 100 ng pofragmentowanego genomowego DNA zastosowano do konstrukcji biblioteki NGS, a sondy obejmujące sekwencje kodujące 123 genów często mutowanych w HCC użyto do ukierunkowanego wychwytywania genów (Baodeng Bio) (Tabela uzupełniająca 1). Bibliotekę NGS zsekwencjonowano z przebiegami sparowanych końców 100 bp w systemie Illumina HiSeq 2000 (Illumina). Średnia głębokość pokrycia dla wszystkich sond wynosiła co najmniej 1000×.

W ukierunkowanym sekwencjonowaniu białych krwinek za pomocą MVI-PG37, 100 ng pofragmentowanego genomowego DNA zastosowano do konstrukcji biblioteki NGS przy użyciu zestawu do konstrukcji biblioteki sekwencjonowania KAPA (Kapa Biosystems). Bibliotekę NGS genomowego DNA przechwycono następnie przez panel Accu-Act (AccuraGen) i zsekwencjonowano z przebiegami sparowanych końców 100 bp w systemie Illumina HiSeq 2500 (Illumina). Średnia głębokość pokrycia dla wszystkich sond wynosiła co najmniej 500×.

W ukierunkowanym sekwencjonowaniu cfDNA za pomocą panelu MVI-PG37 przeprowadzono ocenę opartą na NGS przy użyciu platformy Firefly (AccuraGen), zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami13. Biblioteki NGS sekwencjonowano w systemie Illumina Hi-Seq 2500 (Illumina), a unikalne odczyty sekwencjonowania określono za pomocą zastrzeżonego algorytmu AccuraGen. Średnia głębokość pokrycia dla wszystkich sond wynosiła około 7000×.

Analiza bioinformatyczna dla danych WES i NGS:

Wszystkie dane sekwencjonowania dopasowano do ludzkiej sekwencji odniesienia hg19/GRCh37. W przypadku danych WES mutacje somatyczne, w tym SNP i indele, zidentyfikowano za pomocą algorytmu MuTect2. Obliczono MOAF dla każdego zmutowanego genu somatycznego w celu przeszukania genów związanych z MVI przy użyciu analizy regresji logistycznej, a geny o wartości P <0, 1 wybrano jako kandydatów do wygenerowania panelu genów do dalszego sekwencjonowania cfDNA. Zmutowane geny mutacji linii zarodkowej zidentyfikowano za pomocą algorytmu MutSigCV ze wskaźnikiem fałszywego wykrywania (FDR) <0, 001 jako wartością odcięcia w HCC z lub bez MVI, a następnie włączono do analizy wzbogacenia na podstawie bazy danych GO i KEGG. Zmutowane geny najbardziej wzbogaconych kategorii GO / KEGG zostały skupione, SNP i indele z tych szlaków zostały włączone do analizy regresji logistycznej w celu wykrycia SNP i indeli związanych z MVI o wartości P <0, 05. Geny zawierające znaczące SNP i indele wybrano jako kandydatów do panelu genów.

W przypadku ukierunkowanych danych sekwencjonowania tkanek za pomocą komercyjnego panelu 123 genów mutacje zidentyfikowano za pomocą algorytmu MuTect2. Zmutowane geny zidentyfikowano przy użyciu algorytmu MutSigCV z FDR <0,05 jako punktem odcięcia. Obliczono MOAF każdego zmutowanego genu w celu przeszukania genów związanych z MVI przy użyciu modelu regresji logistycznej z wartością P <0, 05 jako wartością odcięcia.

W przypadku ukierunkowanych danych sekwencjonowania cfDNA i WBC szum tła wprowadzony przez losowy błąd NGS został usunięty przez zastrzeżony algorytm AccuraGen. Dane sekwencjonowania cfDNA i genomowego DNA guza zostały sprawdzone krzyżowo z mutacjami linii zarodkowej z genomowego DNA WBC w celu zidentyfikowania mutacji somatycznych. MOAF obliczono dla każdego zmutowanego genu somatycznego i zastosowano jako sygnatury somatyczne. Status (tak/nie) każdego SNP/indel linii zarodkowej zastosowano jako sygnaturę linii zarodkowej.

Identyfikacja sygnatur genomowych związanych z MVI w cfDNA:

Aby wykryć sygnatury genomowe związane z MVI w cfDNA, sygnatury, w tym MOAF genów somatycznych i status (tak / nie) mutacji linii płciowej, poddano jednowymiarowemu modelowi regresji logistycznej. Podpisy o wartości P <0, 1 zostały użyte do stopniowej selekcji wielu zmiennych w przód przy użyciu kryterium maksymalnego wskaźnika zgodności (indeks C).

Aby dokładnie i wygodnie ocenić wydajność zidentyfikowanych sygnatur związanych z MVI w przewidywaniu MVI, sygnatury genomowe związane z MVI zostały wykorzystane do skonstruowania wyniku opartego na cfDNA przy użyciu współczynników ważonych przez wielowymiarową analizę regresji logistycznej.

Ustanowienie nomogramu do przewidywania MVI Model nomogramu do przewidywania MVI został opracowany przy użyciu wyniku opartego na cfDNA i przedoperacyjnych zmiennych klinicznych związanych z MVI w jedno- i wielowymiarowych analizach regresji logistycznej w kohorcie szkoleniowej. Do budowy modelu wykorzystano analizę regresji logistycznej oraz maszynę wektorów nośnych. Analiza krzywej decyzyjnej (DCA) została wykorzystana do porównania wydajności tych dwóch algorytmów uczenia maszynowego. Do sformułowania nomogramu wykorzystano pakiet rms oprogramowania R. Wydajność modelu oceniono za pomocą wskaźnika zgodności (indeks C) i krzywej kalibracji. Wewnętrzna walidacja wydajności modelu została przeprowadzona przy użyciu walidacji krzyżowej typu „zostaw jeden” (LOO) w kohorcie szkoleniowej, a walidacja zewnętrzna została przeprowadzona przy użyciu danych wieloośrodkowych.

Opracowanie systemu przywracania stopnia zaawansowania HCC we wczesnym stadium Obliczono całkowity wynik nomogramu każdego pacjenta i wykorzystano analizę krzywej ROC odbiornika do obliczenia optymalnej wartości odcięcia nomogramu w celu rozróżnienia wysokiego i niskiego ryzyka dla MVI poprzez maksymalizację wskaźnika Youdena (tj. czułość + specyficzność-1). Dokładność wartości odcięcia została potwierdzona przez czułość, swoistość oraz dodatnie i ujemne wartości predykcyjne. Stosując tę ​​wartość odcięcia, pacjentów z HCC we wczesnym stadium podzielono na dwa podetapy z odpowiednio wysokim lub niskim ryzykiem MVI przewidzianym na podstawie nonogramu.

Analiza statystyczna:

Kliniczne punkty końcowe obejmowały przeżycie wolne od nawrotu choroby (RFS), które zdefiniowano jako czas od operacji do pierwszego rozpoznania wznowy lub zgonu pacjenta bez nawrotu; przeżycie całkowite (OS) zdefiniowano jako czas od operacji do zgonu pacjenta z dowolnej przyczyny lub ostatniej wizyty kontrolnej; a wznowę miejscową zdefiniowano jako wznowę zlokalizowaną w odległości do 2 cm od marginesu resekcji chirurgicznej. Wyniki przeżycia oszacowano za pomocą metody Kaplana-Meiera i testu log-rank. Do identyfikacji niezależnych czynników prognostycznych zastosowano model proporcjonalnego hazardu Coxa. Wartość P <0,05 uznano za istotną statystycznie, o ile nie określono inaczej. Analiza statystyczna została przeprowadzona przy użyciu języka programowania Python w wersji 2.7 (https://www.python.org/) oraz oprogramowanie R w wersji 3.1.1 (http://www.r-project.org/).