A cfDNS-ben található vaszkuláris invázió aláírásai támogatják a májrák újrastádiumát

Dizájnt tanulni:

Kimutatták, hogy a korai stádiumú HCC-ben az MVI-vel kapcsolatos genetikai profilok egy génpanelt hoztak létre a párosított tumor és nem daganatos szövetek WES és célzott gén NGS adatai alapján. Ezután a preoperatív cfDNS-ben az MVI-vel kapcsolatos genomiális váltakozásokat azonosították a panellel végzett célzott szekvenálás segítségével. A cfDNS genomiális aláírásai alapján egy nomogrammodellt állítottak fel az MVI kockázatának preoperatív előrejelzésére, majd a korai stádiumú HCC újrastádiumba állítási paradigmáját dolgozták ki a nomogram által előre jelzett magas vagy alacsony MVI-kockázat alapján. Ezen túlmenően megvizsgálták a re-staging rendszer klinikai jelentőségét a HCC műtéti reszekció optimális mértékének eldöntésében. Ezt a vizsgálatot az egyes központok intézményi etikai bizottsága hagyta jóvá, és minden betegtől tájékozott beleegyezést kaptak szöveteik vagy vérmintáik és klinikai adataik kutatási célokra történő felhasználásához.

Betegek, sebészeti kezelés és nyomon követés:

A jogosultsági kritériumok 18-75 éves betegek voltak, kórszövettanilag igazolt HCC, daganat a milánói kritériumokon belül, Child-Pugh A májműködési osztály, nem szerepelt más rosszindulatú daganat a kórelőzményében, nem részesült korábbi rákellenes kezelésben, beleértve a műtét előtti neoadjuváns kezelést, gyógyító szándékos sebészi reszekció, amely a makroszkopikus csomók teljes eltávolítását jelenti mikroszkopikus tumormentes reszekciós szélekkel, távoli metasztázis és jelentős vaszkuláris invázió nélkül, valamint teljes klinikopatológiai és nyomon követési adatok.

Összesen 436 olyan beteget gyűjtöttek össze, akiken 2015 júniusa és 2017 decembere között korai stádiumú HCC miatt műtéti reszekciót hajtottak végre, és megfeleltek a jogosultsági kritériumoknak. Ezek közül a betegek közül 150 olyan beteg volt, akiket 2015 júniusa és 2016 májusa között operáltak a Keleti Hepatobiliaris Sebészeti Kórházban (EHBH). 81 beteg páros daganatát és szomszédos nem tumoros szöveteit használtuk a WES-hez, további 69 betegéit pedig a célzott gén NGS-hez egy kereskedelmi forgalomban lévő 123 génből álló panel segítségével az MVI-vel kapcsolatos mutációk kimutatására.

További 286 beteget, akiket 2016 júniusa és 2017 decembere között a multicentrumban műtöttek, használtak a cfDNS-vizsgálathoz. Ezeknek a betegeknek a perifériás vérmintáját 30 perccel a műtét előtt vettük a cfDNS kinyerése céljából. A hagyományos preoperatív értékelés mellett a jövőbeni májmaradvány (FLR) volumetrikus értékelését a képalkotó vizsgálatok háromdimenziós rekonstrukciójával végezték. Minden reszekciót azzal a szándékkal végeztünk, hogy a daganatos csomó(k) teljes eltávolítását anatómiai vagy nem anatómiai reszekciókkal végezzük. A műtéti reszekciós határ szélességét végül a műtétet végző sebészek határozták meg a tumor mérete, a tumor száma, az intrahepatikus lokalizáció, a képalkotó vizsgálatok során a daganat lokális invazív jellemzői, a cirrhosis, az FLR becsült mennyisége, a májfunkció és a betegek általános állapota alapján. , valamint a sebész tapasztalatairól, mint egy tanulmány a valós gyakorlatról. A betegeket a műtét után rendszeresen ellenőrizték. A tumor kiújulását/áttétet úgy határoztuk meg, mint új lézió(k) megjelenését, amelyeket legalább két radiológiai képalkotó módszerrel igazoltak, a szérum tumormarkerek emelkedésével vagy anélkül.

A 286 beteg közül 125 az EHBH-ból adódott a cfDNS-ben az MVI-vel kapcsolatos genomiális jellemzők azonosítására és az MVI-előrejelző modell kidolgozására szolgáló képzési csoportba, míg a fennmaradó 161 beteg multicentrumból (a nankingi Délkeleti Egyetem Zhongda Kórháza, Sun Yat). -Sen Memory Kórház a Sun Yat-Sun Egyetemen, Guangzhou; a Mengchao Hepatobiliary Surgery Hospital a Fujian Medical University, Fuzhou; és az EHBH, Shanghai) szolgált külső validációs csoportként a modell teljesítményének ellenőrzéséhez.

Preoperatív klinikai változók:

Mind a cfDNS-ben lévő MVI-vel kapcsolatos genomiális aláírásokat, mind a preoperatív klinikai változókat, amelyek valószínűleg az MVI-vel társultak, felhasználták az MVI független kockázati tényezőinek azonosítására az MVI-előrejelző modell kidolgozásához. A preoperatív klinikai változók a következők voltak: életkor, nem, összbilirubin (TBIL), alanin-aminotranszferáz (ALT), aszpartát-aminotranszferáz (AST), albumin, vérlemezkék, protrombin idő (PT), α-fetoprotein (AFP), K-vitamin hiánya által kiváltott protrombin -II (PIVKA-II), hepatitis B és C szerológia, HBV-DNS szintek és képalkotó jellemzők, mint például a daganatok száma, a daganat átmérője és a cirrhosis preoperatív kontrasztanyagos CT-vizsgálaton és/vagy mágneses rezonancia képalkotáson (MRI).

Az MVI kórszövettani diagnózisa:

A műtéti úton eltávolított mintákat a műtét után rutinszerűen szövettanilag megvizsgáltuk. A szövetminták minőségének biztosítása érdekében az MVI kimutatásában a Kínai Orvosi Társaság (CMS) Patológiai részlege által javasolt hét helyszínes mintavételi protokollt alkalmaztak. A daganatos és nem tumoros májszövetek metszeteit megvizsgáltuk az MVI jelenlétének megfigyelésére. Az MVI hisztopatológiai diagnózisa összhangban volt a korábbi jelentésekkel. Röviden, az MVI-t azonosították, ha mikrovaszkuláris rákos embólus vagy rákos sejtfészek volt a szomszédos májszövetekben a portális véna vagy a májvéna kis ágaiban, vagy a csak mikroszkóppal látható endotéliummal bélelt nagy kapszuláris erekben. Mindegyik központban ugyanazokat a kritériumokat alkalmazták az MVI kórszövettani diagnózisához. A műtéti reszekciós szél szélességét a májreszekció utáni nyers felület és a tumorkapszula közötti legközelebbi távolságként határoztuk meg. Az összes kórszövettani vizsgálatot egymástól függetlenül három patológus végezte, akik viták során konszenzusra jutottak, ha bármilyen vita volt.

Alkalmasság értékelése széles és keskeny szélű reszekcióra A 286 beteg közül a szűk szélű reszekción átesett betegeket a műtét után újraértékelték annak megállapítására, hogy alkalmasak-e széles szélű reszekcióra is. Három vezető májsebész, akik nem látták a prognosztikai információkat, áttekintették ezen betegek preoperatív adatait. Olyan képalkotó jellemzők alapján, mint a tumor mérete, a daganat száma, a tumor kapszula státusza, a daganat intrahepatikus elhelyezkedése, az FLR4 becsült térfogata, a cirrhosis mértéke, a májfunkció, az általános teljesítmény, valamint a saját műtéti tapasztalataik. Az értékelés a műszaki megvalósíthatóságon és a műtéti biztonságon alapult.

Szövet- és vérminták:

Friss szövetmintákat gyűjtöttünk, és felhasználásig -80 ℃-on tároltuk. A perifériás vért (mintánként 10 ml) EDTA vacutainer csövekbe gyűjtöttük a műtét előtt 30 percen belül, a gyűjtést követő 1 órán belül feldolgoztuk, és 1600 g-vel 10 percig centrifugálással elválasztottuk, mikrocentrifugacsövekbe vittük át és 20 000 g-vel centrifugáltuk 10 percig. perc a sejttörmelék eltávolítására. Mind a plazmát, mind a fehérvérsejteket összegyűjtöttük, és felhasználásig -80 ℃-on tároltuk.

Genomi DNS és cfDNS extrakció:

A tumorszövetekből és fehérvérsejtekből származó genomi DNS-t a DNeasy Tissue vagy Blood Kit (Qiagen) segítségével extraháltuk, majd a Covaris S2 SonoLAB (Covaris) segítségével 200 és 400 bp közötti méretre fragmentáltuk. Minden beteg 3-5 ml plazmájából cfDNS-t izoláltunk a QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen) segítségével. A DNS-t a gyártó utasításai szerint extraháltuk, Qubit fluorométerrel (Life Technologies) határoztuk meg, és felhasználásig -80 ℃-on tartottuk.

Teljes exome szekvenálás:

Mintánként 1 μg DNS-t használtunk bemeneti anyagként a DNS-könyvtár elkészítéséhez. A szekvenáló könyvtárat a SureSelect XT Target Enrichment System for Illumina Paired-End Sequencing Library (Agilent) segítségével hoztuk létre, és minden mintához indexkódokat adtunk. A genomi DNS-mintákat ultrahangos kezeléssel körülbelül 400 bp átlagos méretre fragmentáltuk. A DNS-fragmensek végét políroztuk, a-farokkal ligáltuk, és a teljes hosszúságú adapterrel ligáltuk a szekvenáláshoz, majd PCR-amplifikációt végeztünk. A könyvtárakat méreteloszlás szempontjából Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent) segítségével elemeztük. Az index-kódolt minták klaszterezése cBot Cluster Generation System (Illumina) segítségével történt a gyártó utasításai szerint. A klasztergenerálás után a DNS-könyvtárakat Illumina HiSeq 2000 platformon szekvenáltuk, és páros végű 2×100 nt multiplex szekvenálási leolvasásokat generáltunk.

Célzott gén következő generációs szekvenálás:

A HCC szövetek célzott szekvenálása során a kereskedelmi forgalomban lévő 123 génből álló panellel 100 ng fragmentált genomiális DNS-t használtak az NGS-könyvtár felépítéséhez, a HCC-ben gyakran mutált 123 gén kódoló szekvenciáját felölelő próbákat pedig a célzott génbefogáshoz (Baodeng Bio) (1. kiegészítő táblázat). Az NGS-könyvtárat 100 bp-os páros végű futtatással szekvenáltuk Illumina HiSeq 2000 rendszeren (Illumina). Az összes szonda átlagos lefedettségi mélysége legalább 1000× volt.

A fehérvérsejtek MVI-PG37-tel történő célzott szekvenálása során 100 ng fragmentált genomiális DNS-t használtunk az NGS-könyvtár felépítéséhez, KAPA szekvenáló könyvtár építőkészlettel (Kapa Biosystems). A genomi DNS NGS-könyvtárat ezután az Accu-Act panel (AccuraGen) rögzítette, és 100 bp-os páros végű futtatással szekvenáltuk Illumina HiSeq 2500 rendszeren (Illumina). Az összes szonda átlagos lefedettségi mélysége legalább 500× volt.

A cfDNS célzott szekvenálása során az MVI-PG37 panellel az NGS-alapú értékelést a Firefly platform (AccuraGen) segítségével végezték el, amint arról korábban beszámoltunk13. Az NGS-könyvtárakat Illumina Hi-Seq 2500 rendszeren (Illumina) szekvenáltuk, és az egyedi szekvenálási leolvasásokat egy AccuraGen szabadalmaztatott algoritmussal határoztuk meg. Az összes szonda átlagos lefedettségi mélysége körülbelül 7000× volt.

Bioinformatikai elemzés a WES és az NGS adatokhoz:

Minden szekvenálási adatot a hg19/GRCh37 humán referenciaszekvenciához igazítottunk. A WES adatok esetében a szomatikus mutációkat, beleértve az SNP-ket és az indeleket, a MuTect2 algoritmus azonosította. Minden szomatikus mutáns gén MOAF-értékét kiszámítottuk az MVI-vel kapcsolatos gének szűrésére logisztikus regressziós analízis segítségével, és a 0,1-nél kisebb P-értékű géneket jelölték ki a génpanel létrehozására a cfDNS további szekvenálásához. A csíravonal-mutációk mutált génjeit a MutSigCV algoritmus segítségével azonosították, 0,001-nél kisebb hamis felfedezési rátával (FDR), mint küszöbértékként HCC-ben MVI-vel vagy anélkül, majd bevonták őket a GO és KEGG adatbázison alapuló dúsítási elemzésbe. A legjelentősebben dúsított GO/KEGG kategóriák mutált génjeit fókuszáltuk, ezekből az útvonalakból származó SNP-ket és indeleket bevontuk a logisztikus regressziós analízisbe az MVI-hez kapcsolódó SNP-k és indelek kimutatására <0,05 P-értékkel. A génpanel jelöltjeiként a jelentős SNP-ket és indeleket tartalmazó géneket választottuk ki.

A szövetek célzott szekvenálási adataihoz a kereskedelmi 123 génből álló panellel a mutációkat a MuTect2 algoritmus azonosította. A mutált géneket a MutSigCV algoritmussal azonosítottuk, 0,05-nél kisebb FDR értékkel. Mindegyik mutált gén MOAF-ját kiszámítottuk az MVI-vel kapcsolatos gének szűrésére logisztikus regressziós modellt használva, ahol a P érték <0,05 volt, mint küszöbérték.

A cfDNS és WBC-k célzott szekvenálási adatainál a véletlenszerű NGS-hiba által okozott háttérzajt az AccuraGen szabadalmaztatott algoritmusa távolította el. A cfDNS és a tumor genomiális DNS szekvenálási adatait a fehérvérsejtek genomiális DNS-éből származó csíravonal-mutációval kereszteztük a szomatikus mutációk azonosítása érdekében. A MOAF-ot minden szomatikus mutált génre kiszámítottuk, és szomatikus aláírásként használtuk. Minden csíravonal SNP/indel állapotát (igen/nem) használták csíravonal aláírásként.

Az MVI-hez kapcsolódó genomiális aláírások azonosítása cfDNS-ben:

Az MVI-vel kapcsolatos genomiális aláírások cfDNS-ben történő kimutatására a szomatikus gének MOAF-ját és a csíravonal-mutációk állapotát (igen/nem) vetettük alá az egyváltozós logisztikus regressziós modellnek. A <0,1 P értékű aláírásokat a maximális konkordanciaindex (C-index) kritériumot használó előre lépésenkénti többváltozós kiválasztáshoz használtuk.

Az azonosított MVI-vel kapcsolatos szignatúrák teljesítményének pontos és kényelmes értékeléséhez az MVI előrejelzésében, az MVI-vel kapcsolatos genomi szignatúrákat használták fel egy cfDNS-alapú pontszám létrehozására, a többváltozós logisztikus regressziós analízissel súlyozott együtthatók felhasználásával.

Az MVI előrejelzésére szolgáló nomogram felállítása Az MVI előrejelzésére szolgáló nomogrammodellt a cfDNS-alapú pontszám és az MVI-hez kapcsolódó preoperatív klinikai változók felhasználásával fejlesztették ki a tréning kohorszban végzett egy- és többváltozós logisztikus regressziós elemzések során. A modell felépítéséhez logisztikus regresszióanalízist és támogató vektorgépet használtunk. Döntési görbe elemzést (DCA) használtunk a két gépi tanulási algoritmus teljesítményének összehasonlítására. A nomogram megfogalmazásához az R szoftver rms csomagját használtuk. A modell teljesítményét a konkordancia index (C-index) és a kalibrációs görbe segítségével értékeltük. A modell teljesítményének belső validálása egy kihagyás (LOO) keresztellenőrzéssel történt a képzési kohorszban, a külső validálás pedig többközpontú adatok felhasználásával.

Re-staging rendszer fejlesztése korai stádiumú HCC számára Az egyes betegek teljes nomogram pontszámát kiszámítottuk, és a vevő működési karakterisztikája (ROC) görbe elemzésével kiszámították a nomogram optimális határértékét a magas és az alacsony kockázat megkülönböztetésére. MVI esetében a Youden index maximalizálásával (azaz érzékenység+specifitás-1). A küszöbérték pontosságát az érzékenység, a specificitás, valamint a pozitív és negatív prediktív értékek igazolták. Ezzel a küszöbértékkel a korai stádiumú HCC-ben szenvedő betegeket két alszakaszra osztották, amelyekben a nem-gramm alapján magas vagy alacsony MVI-kockázat volt.

Statisztikai analízis:

A klinikai végpontok közé tartozott a recidívamentes túlélés (RFS), amelyet a műtéttől a kiújulás vagy a beteg kiújulás nélküli halálának első diagnózisáig eltelt időként határoztak meg; a teljes túlélést (OS) úgy határozták meg, mint a műtéttől a beteg bármely okból bekövetkezett haláláig eltelt időt vagy az utolsó utánkövetést; lokális recidívának minősül minden olyan recidíva, amely a műtéti reszekciós határtól számított 2 cm-en belül található. A túlélési eredményeket Kaplan-Meier módszerrel és log-rank teszttel becsülték meg. A független prognosztikai tényezők azonosítására a Cox-féle arányos kockázati modellt alkalmaztuk. A 0,05-nél kisebb P értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük, hacsak másként nem jelezzük. A statisztikai elemzést a python programozási nyelv 2.7-es verziójával végeztük (https://www.python.org/) és az R szoftver 3.1.1-es verziója (http://www.r-project.org/).