Le firme dell'invasione vascolare nel cfDNA supportano la rimessa in scena del cancro al fegato

Disegno dello studio:

I profili genetici associati a MVI nell'HCC in fase iniziale sono stati rilevati per generare un pannello genetico basato sul WES e sui dati NGS del gene mirato di tessuti tumorali e non tumorali accoppiati. Quindi, le alternanze genomiche correlate a MVI nel cfDNA preoperatorio sono state identificate utilizzando il sequenziamento mirato con il pannello. Sulla base delle firme genomiche nel cfDNA, è stato costruito un modello di nomogramma per prevedere i rischi di MVI prima dell'intervento e successivamente è stato sviluppato un paradigma di rimessa in scena per l'HCC in fase iniziale basato sul rischio alto o basso previsto di MVI dal nomogramma. Inoltre, è stata esaminata la rilevanza clinica del sistema di ri-stadiazione nel decidere l'estensione ottimale della resezione chirurgica per l'HCC. Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale di ciascun centro e tutti i pazienti hanno ottenuto il consenso informato per l'utilizzo dei loro tessuti o campioni di sangue e dati clinici a fini di ricerca.

Pazienti, trattamento chirurgico e follow-up:

I criteri di eleggibilità erano pazienti di età compresa tra 18 e 75 anni, HCC confermato istopatologicamente, tumore che rientrava nei criteri di Milano, funzionalità epatica di classe Child-Pugh A, nessuna storia di altre neoplasie, nessun precedente trattamento antitumorale inclusa la terapia neoadiuvante prima dell'intervento chirurgico, resezione chirurgica intent definita come rimozione completa di noduli macroscopici con margini di resezione microscopici privi di tumore e senza metastasi a distanza e invasione vascolare maggiore, e dati clinicopatologici e di follow-up completi.

Sono stati raccolti in modo prospettico un totale di 436 pazienti sottoposti a resezione chirurgica per HCC in fase iniziale tra giugno 2015 e dicembre 2017 e che soddisfacevano i criteri di ammissibilità. Di questi pazienti, 150 pazienti che sono stati operati tra giugno 2015 e maggio 2016 presso l'Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital (EHBH) sono stati la coorte di scoperta del panel. Il tumore accoppiato e i tessuti adiacenti non tumorali di 81 pazienti sono stati utilizzati per WES e quelli di altri 69 pazienti erano per il gene mirato NGS utilizzando un pannello commerciale di 123 geni per rilevare le mutazioni correlate a MVI.

Altri 286 pazienti sottoposti a intervento chirurgico tra giugno 2016 e dicembre 2017 presso centri multicentrici sono stati utilizzati per il test del cfDNA. I campioni di sangue periferico di questi pazienti sono stati raccolti 30 minuti prima dell'intervento chirurgico per estrarre il cfDNA. Oltre alla valutazione preoperatoria convenzionale, è stata eseguita la valutazione volumetrica per il futuro residuo epatico (FLR) utilizzando la ricostruzione tridimensionale degli studi di imaging. Tutte le resezioni sono state eseguite con l'intenzione di rimuovere completamente i noduli tumorali con resezioni anatomiche o non anatomiche. L'ampiezza del margine di resezione chirurgica è stata infine decisa dai chirurghi operanti in base alle dimensioni del tumore, al numero del tumore, alla localizzazione intraepatica, alle caratteristiche invasive locali del tumore negli studi di imaging, alla cirrosi, al volume stimato di FLR, alla funzionalità epatica e alle condizioni generali dei pazienti come riportato in precedenza , nonché sull'esperienza del chirurgo come studio sulla pratica del mondo reale. I pazienti sono stati seguiti regolarmente dopo l'intervento chirurgico. La recidiva/metastasi tumorale è stata definita come comparsa di nuove lesioni confermate su almeno due tecniche di imaging radiologico, con o senza elevazione dei marcatori tumorali sierici.

Tra questi 286 pazienti, 125 dell'EHBH comprendevano la coorte di addestramento per l'identificazione delle caratteristiche genomiche associate a MVI nel cfDNA e per lo sviluppo di un modello di previsione di MVI, mentre i restanti 161 pazienti provenienti da centri multicentrici (Zhongda Hospital of Southeast University, Nanjing; Sun Yat -Sen Memory Hospital della Sun Yat-Sun University, Guangzhou; il Mengchao Hepatobiliary Surgery Hospital della Fujian Medical University, Fuzhou; e l'EHBH, Shanghai) sono serviti come coorte di convalida esterna per verificare le prestazioni del modello.

Variabili cliniche preoperatorie:

Sia le firme genomiche correlate a MVI nel cfDNA che le variabili cliniche preoperatorie che erano possibilmente associate a MVI sono state utilizzate per identificare i fattori di rischio indipendenti di MVI per sviluppare il modello di previsione di MVI. Le variabili cliniche preoperatorie includevano età, sesso, bilirubina totale (TBIL), alanina aminotransferasi (ALT), aspartato aminotransferasi (AST), albumina, piastrine, tempo di protrombina (PT), α-fetoproteina (AFP), protrombina indotta dall'assenza di vitamina K -II (PIVKA-II), sierologia dell'epatite B e C, livelli di HBV-DNA e caratteristiche di imaging come il numero del tumore, il diametro del tumore e la cirrosi alla TC preoperatoria con mezzo di contrasto e/o alla risonanza magnetica (MRI).

Diagnosi istopatologica di MVI:

I campioni resecati chirurgicamente sono stati regolarmente esaminati istopatologicamente dopo l'intervento chirurgico. Per garantire la qualità dei campioni di tessuto nel rilevamento di MVI, è stato utilizzato un protocollo di campionamento a sette siti raccomandato dal ramo di patologia della Società medica cinese (CMS). Sezioni di tessuti epatici tumorali e non tumorali sono state esaminate per osservare la presenza di MVI. La diagnosi istopatologica di MVI era in linea con i rapporti precedenti. In breve, MVI è stato identificato se c'era un embolo tumorale microvascolare o un nido di cellule tumorali in piccoli rami della vena porta o della vena epatica nei tessuti epatici adiacenti, o in grandi vasi capsulari rivestiti da endotelio che era visibile solo al microscopio. In ogni centro sono stati utilizzati gli stessi criteri per la diagnosi istopatologica di MVI. La larghezza del margine di resezione chirurgica è stata definita come la distanza più vicina tra la superficie grezza dopo resezione epatica e la capsula tumorale. Tutti gli studi istopatologici sono stati condotti in modo indipendente da tre patologi che sono giunti a un consenso mediante discussione in caso di controversie.

Valutazione dell'idoneità per resezioni a margine ampio e stretto Tra i 286 pazienti, i pazienti sottoposti a resezione a margine stretto sono stati rivalutati dopo l'intervento per determinare se fossero idonei anche per una resezione a margine ampio. Tre chirurghi epatici senior che erano all'oscuro delle informazioni prognostiche hanno rivisto i dati preoperatori di questi pazienti. Sulla base delle caratteristiche di imaging tra cui dimensioni del tumore, numero del tumore, stato della capsula tumorale, posizione intraepatica del tumore, volume stimato di FLR4, grado di cirrosi, funzionalità epatica, prestazioni generali, nonché la propria esperienza chirurgica. La valutazione si è basata sulla fattibilità tecnica e sulla sicurezza chirurgica.

Campioni di tessuto e sangue:

Campioni di tessuto fresco sono stati raccolti e conservati a -80°C fino al momento dell'uso. Il sangue periferico (10 mL per campione) è stato raccolto in provette vacutainer EDTA entro 30 minuti prima dell'intervento chirurgico, processato entro 1 ora dalla raccolta e separato mediante centrifugazione a 1.600 g per 10 minuti, trasferito in provette per microcentrifuga e centrifugato a 20.000 g per 10 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Sia il plasma che i globuli bianchi sono stati raccolti e conservati a -80°C fino al momento dell'uso.

Estrazione di DNA genomico ed cfDNA:

Il DNA genomico dai tessuti tumorali e dai globuli bianchi è stato estratto dal DNeasy Tissue or Blood Kit (Qiagen) e quindi frammentato a una dimensione compresa tra 200 e 400 bp utilizzando il Covaris S2 SonoLAB (Covaris). Il cfDNA è stato isolato da 3-5 mL di plasma di ciascun paziente utilizzando il QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen). Il DNA è stato estratto secondo le istruzioni del produttore, quantificato da un fluorometro Qubit (Life Technologies) e mantenuto a -80°C fino all'uso.

Sequenziamento dell'intero esoma:

1 μg di DNA per campione è stato utilizzato come materiale di input per la preparazione della libreria del DNA. La libreria di sequenziamento è stata generata utilizzando il sistema di arricchimento del target SureSelect XT per la libreria di sequenziamento paired-end Illumina (Agilent) e i codici indice sono stati aggiunti a ciascun campione. I campioni di DNA genomico sono stati frammentati mediante sonicazione a una dimensione media di ~ 400 bp. I frammenti di DNA sono stati lucidati all'estremità, a coda e ligati con l'adattatore a lunghezza intera per il sequenziamento, seguito dall'amplificazione PCR. Le librerie sono state analizzate per la distribuzione delle dimensioni utilizzando un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent). Il raggruppamento dei campioni con codice indice è stato eseguito utilizzando un sistema di generazione di cluster cBot (Illumina) secondo le istruzioni del produttore. Dopo la generazione del cluster, le librerie di DNA sono state sequenziate sulla piattaforma Illumina HiSeq 2000 e sono state generate letture di sequenziamento multiplex 2 × 100 nt paired-end.

Sequenziamento genico mirato di nuova generazione:

Nel sequenziamento mirato dei tessuti HCC con il pannello commerciale di 123 geni, sono stati utilizzati 100 ng di DNA genomico frammentato per la costruzione della libreria NGS e sono state utilizzate sonde che coprono le sequenze codificanti di 123 geni frequentemente mutati nell'HCC per la cattura genica mirata (Baodeng Bio) (Tabella supplementare 1). La libreria NGS è stata sequenziata con corse paired-end da 100 bp su un sistema Illumina HiSeq 2000 (Illumina). La profondità media di copertura per tutte le sonde era almeno 1000×.

Nel sequenziamento mirato dei globuli bianchi con MVI-PG37, sono stati utilizzati 100 ng di DNA genomico frammentato per la costruzione della libreria NGS utilizzando un kit di costruzione della libreria di sequenziamento KAPA (Kapa Biosystems). La libreria genomica di DNA NGS è stata quindi acquisita dal pannello Accu-Act (AccuraGen) ed è stata sequenziata con corse paired-end da 100 bp su un sistema Illumina HiSeq 2500 (Illumina). La profondità media di copertura per tutte le sonde era di almeno 500×.

Nel sequenziamento mirato di cfDNA con il pannello MVI-PG37, la valutazione basata su NGS è stata eseguita utilizzando la piattaforma Firefly (AccuraGen) come riportato in precedenza13. Le librerie NGS sono state sequenziate su un sistema Illumina Hi-Seq 2500 (Illumina) e le letture di sequenziamento univoche sono state determinate utilizzando un algoritmo proprietario AccuraGen. La profondità media di copertura per tutte le sonde era di circa 7000×.

Analisi bioinformatica per i dati WES e NGS:

Tutti i dati di sequenziamento sono stati allineati alla sequenza di riferimento umana hg19/GRCh37. Per i dati WES, le mutazioni somatiche inclusi SNP e indel sono state identificate dall'algoritmo MuTect2. Il MOAF per ciascun gene mutato somatico è stato calcolato per schermare i geni correlati a MVI utilizzando l'analisi di regressione logistica e i geni con un valore P <0, 1 sono stati selezionati come candidati per generare il pannello genico per l'ulteriore sequenziamento del cfDNA. I geni mutati delle mutazioni germinali sono stati identificati utilizzando l'algoritmo MutSigCV con un tasso di scoperta falsa (FDR) di <0,001 come cut-off in HCC con o senza MVI, e quindi sono stati inclusi nell'analisi di arricchimento basata sul database GO e KEGG. I geni mutati delle categorie GO/KEGG più significativamente arricchite sono stati focalizzati, gli SNP e gli indel di questi percorsi sono stati inclusi nell'analisi di regressione logistica per rilevare gli SNP e gli indel associati a MVI con un valore P <0,05. I geni contenenti SNP e indel significativi sono stati selezionati come candidati del pannello genetico.

Per i dati di sequenziamento mirato dei tessuti con il pannello del gene 123 commerciale, le mutazioni sono state identificate dall'algoritmo MuTect2. I geni mutati sono stati identificati utilizzando l'algoritmo MutSigCV con un FDR <0,05 come cut-off. Il MOAF di ciascun gene mutato è stato calcolato per schermare i geni correlati a MVI utilizzando il modello di regressione logistica con un valore P <0,05 come cutoff.

Per i dati di sequenziamento mirati di cfDNA e WBC, il rumore di fondo introdotto da un errore NGS casuale è stato rimosso dall'algoritmo proprietario AccuraGen. I dati di sequenziamento del DNA genomico del cfDNA e del tumore sono stati confrontati con la mutazione della linea germinale dal DNA genomico dei globuli bianchi per identificare le mutazioni somatiche. MOAF è stato calcolato per ciascun gene mutato somatico e utilizzato come firme somatiche. Lo stato (sì/no) di ciascun SNP/indel della linea germinale è stato utilizzato come firma della linea germinale.

Identificazione delle firme genomiche correlate a MVI in cfDNA:

Per rilevare le firme genomiche correlate a MVI nel cfDNA, le firme che includevano MOAF dei geni somatici e lo stato (sì/no) delle mutazioni germinali sono state sottoposte al modello di regressione logistica univariata. Le firme con un valore P <0,1 sono state utilizzate per la selezione multivariata graduale in avanti utilizzando il criterio dell'indice di concordanza massimo (indice C).

Per valutare in modo accurato e conveniente le prestazioni delle firme correlate a MVI identificate nella previsione di MVI, le firme genomiche correlate a MVI sono state utilizzate per costruire un punteggio basato su cfDNA utilizzando i coefficienti pesati dall'analisi di regressione logistica multivariata.

Istituzione di un nomogramma per predire MVI Il modello di nomogramma per prevedere MVI è stato sviluppato utilizzando il punteggio basato su cfDNA e le variabili cliniche preoperatorie associate a MVI su analisi di regressione logistica univariata e multivariata nella coorte di addestramento. Per costruire il modello sono state utilizzate l'analisi di regressione logistica e la macchina vettoriale di supporto. L'analisi della curva di decisione (DCA) è stata utilizzata per confrontare le prestazioni tra questi due algoritmi di apprendimento automatico. Il pacchetto rms del software R è stato utilizzato per formulare il nomogramma. Le prestazioni del modello sono state valutate dall'indice di concordanza (indice C) e dalla curva di calibrazione. La convalida interna per le prestazioni del modello è stata eseguita utilizzando la convalida incrociata leave-one-out (LOO) nella coorte di addestramento e la convalida esterna è stata eseguita utilizzando dati multicentrici.

Sviluppo di un sistema di ri-stadiazione per l'HCC in stadio iniziale È stato calcolato il punteggio totale del nomogramma di ciascun paziente e l'analisi della curva delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC) è stata utilizzata per calcolare il valore di cutoff ottimale del nomogramma per distinguere tra rischio alto e basso per MVI massimizzando l'indice Youden (cioè sensibilità + specificità-1). L'accuratezza del valore di cut-off è stata confermata da sensibilità, specificità e valori predittivi positivi e negativi. Usando questo valore di cutoff, i pazienti con HCC in stadio iniziale sono stati stratificati in due sottostadi con rispettivamente alto o basso rischio di MVI previsto dal nonogramma.

Analisi statistica:

Gli endpoint clinici includevano la sopravvivenza libera da recidiva (RFS) che è stata definita come il tempo dall'intervento chirurgico alla prima diagnosi di recidiva o morte del paziente senza recidiva; la sopravvivenza globale (OS) è stata definita come il tempo dall'intervento chirurgico alla morte del paziente per qualsiasi causa o all'ultimo follow-up; e la recidiva locale è stata definita come qualsiasi recidiva localizzata entro 2 cm dal margine di resezione chirurgica. Gli esiti di sopravvivenza sono stati stimati utilizzando il metodo Kaplan-Meier e il log-rank test. Il modello dei rischi proporzionali di Cox è stato utilizzato per identificare i fattori prognostici indipendenti. Un valore P <0,05 è stato considerato statisticamente significativo, se non diversamente specificato. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il linguaggio di programmazione Python versione 2.7 (https://www.python.org/) e la versione software R 3.1.1 (http://www.r-project.org/).