Assinaturas de invasão vascular no cfDNA apoiam o reestadiamento do câncer de fígado

Design de estudo:

Os perfis genéticos associados ao MVI no HCC em estágio inicial foram detectados para gerar um painel de genes com base nos dados de WES e NGS de genes direcionados de tecidos tumorais e não tumorais pareados. Em seguida, as alternâncias genômicas relacionadas ao MVI no cfDNA pré-operatório foram identificadas usando o sequenciamento direcionado com o painel. Com base nas assinaturas genômicas no cfDNA, um modelo de nomograma foi construído para prever os riscos de MVI no pré-operatório, e um paradigma de reestadiamento para HCC em estágio inicial com base no alto ou baixo risco previsto de MVI pelo nomograma foi desenvolvido posteriormente. Além disso, foi examinada a relevância clínica do sistema de reestadiamento na decisão sobre a extensão ideal da ressecção cirúrgica para CHC. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional de cada centro, e os consentimentos informados foram obtidos de todos os pacientes para que seus tecidos ou amostras de sangue e dados clínicos fossem usados ​​para fins de pesquisa.

Pacientes, Tratamento Cirúrgico e Acompanhamento:

Os critérios de elegibilidade foram pacientes com idade entre 18 e 75 anos, CHC confirmado histopatologicamente, tumor dentro dos critérios de Milão, função hepática classe A de Child-Pugh, sem história de outras malignidades, sem tratamento anticâncer anterior, incluindo terapia neoadjuvante antes da cirurgia, curativo- ressecção cirúrgica intencional definida como a remoção completa de nódulos macroscópicos com margens de ressecção microscópicas livres de tumor e sem metástase à distância e invasão vascular importante, e dados clínico-patológicos e de acompanhamento completos.

Um total de 436 pacientes submetidos à ressecção cirúrgica para CHC em estágio inicial entre junho de 2015 e dezembro de 2017 e que atenderam aos critérios de elegibilidade foram coletados prospectivamente. Desses pacientes, 150 pacientes operados entre junho de 2015 e maio de 2016 no Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital (EHBH) serviram como coorte de descoberta do painel. Tumores pareados e tecidos não tumorais adjacentes de 81 pacientes foram usados ​​para WES, e aqueles de outros 69 pacientes foram para o gene NGS direcionado usando um painel comercial de 123 genes para detectar mutações relacionadas ao MVI.

Outros 286 pacientes operados entre junho de 2016 e dezembro de 2017 em multicentros foram usados ​​no teste de cfDNA. Amostras de sangue periférico desses pacientes foram coletadas 30 minutos antes da cirurgia para extrair o cfDNA. Além da avaliação pré-operatória convencional, a avaliação volumétrica para futuro remanescente hepático (FLR) foi realizada por meio de reconstrução tridimensional de estudos de imagem. Todas as ressecções foram realizadas com a intenção de remover completamente o(s) nódulo(s) tumoral(is) com ressecções anatômicas ou não anatômicas. A largura da margem de ressecção cirúrgica foi finalmente decidida pelos cirurgiões operacionais com base no tamanho do tumor, número do tumor, localização intra-hepática, características invasivas locais do tumor em estudos de imagem, cirrose, volume estimado de FLR, função hepática e estado geral dos pacientes, conforme relatado anteriormente , bem como na experiência do cirurgião como um estudo sobre a prática do mundo real. Os pacientes foram acompanhados regularmente após a cirurgia. Recorrência/metástase tumoral foi definida como aparecimento de nova(s) lesão(ões) confirmada(s) em pelo menos duas técnicas de imagem radiológica, com ou sem elevação de marcadores tumorais séricos.

Entre esses 286 pacientes, 125 do EHBH compuseram a coorte de treinamento para identificar características genômicas associadas ao MVI no cfDNA e no desenvolvimento de um modelo de previsão do MVI, enquanto os 161 pacientes restantes de multicêntricos (o Hospital Zhongda da Southeast University, Nanjing; Sun Yat -Sen Memory Hospital da Sun Yat-Sun University, Guangzhou; o Mengchao Hepatobiliary Surgery Hospital da Fujian Medical University, Fuzhou; e o EHBH, Shanghai) serviram como coorte de validação externa para verificar o desempenho do modelo.

Variáveis ​​clínicas pré-operatórias:

Ambas as assinaturas genômicas relacionadas ao MVI no cfDNA e as variáveis ​​clínicas pré-operatórias que foram possivelmente associadas ao MVI foram usadas na identificação de fatores de risco independentes de MVI para desenvolver o modelo de previsão de MVI. As variáveis ​​clínicas pré-operatórias incluíram idade, sexo, bilirrubina total (TBIL), alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), albumina, plaquetas, tempo de protrombina (PT), α-fetoproteína (AFP), protrombina induzida pela ausência de vitamina K -II (PIVKA-II), sorologia para hepatite B e C, níveis de HBV-DNA e características de imagem, como número do tumor, diâmetro do tumor e cirrose na tomografia computadorizada pré-operatória com contraste e/ou ressonância magnética (MRI).

Diagnóstico histopatológico de MVI:

Espécimes ressecados cirurgicamente foram rotineiramente examinados histopatologicamente após a cirurgia. Para garantir a qualidade das amostras de tecido na detecção de MVI, foi utilizado um protocolo de amostragem de sete locais recomendado pelo Ramo de Patologia da Sociedade Médica Chinesa (CMS). Seções de tecido hepático tumoral e não tumoral foram examinadas para observar a presença de MVI. O diagnóstico histopatológico de MVI estava de acordo com relatos anteriores. Resumidamente, MVI foi identificado se houvesse um êmbolo de câncer microvascular ou ninho de células cancerígenas em pequenos ramos da veia porta ou veia hepática nos tecidos adjacentes do fígado, ou em grandes vasos capsulares revestidos por endotélio que era visível apenas na microscopia. Os mesmos critérios para o diagnóstico histopatológico de MVI foram utilizados em cada centro. A largura da margem de ressecção cirúrgica foi definida como a distância mais próxima entre a superfície cruenta após ressecção hepática e a cápsula tumoral. Todos os estudos histopatológicos foram realizados de forma independente por três patologistas que chegaram a um consenso por meio de discussão, caso houvesse alguma controvérsia.

Avaliação da adequação para ressecções com margens amplas e estreitas Entre os 286 pacientes, os pacientes submetidos a uma ressecção com margens estreitas foram reavaliados no pós-operatório para determinar se também eram adequados para uma ressecção com margens amplas. Três cirurgiões hepáticos seniores que desconheciam as informações prognósticas revisaram os dados pré-operatórios desses pacientes. Com base em características de imagem, incluindo tamanho do tumor, número do tumor, estado da cápsula do tumor, localização intra-hepática do tumor, volume estimado de FLR4, grau de cirrose, função hepática, desempenho geral, bem como sua própria experiência cirúrgica. A avaliação foi baseada na viabilidade técnica e segurança cirúrgica.

Amostras de Tecido e Sangue:

Amostras de tecido fresco foram coletadas e armazenadas a -80 ℃ até o uso. O sangue periférico (10 mL por amostra) foi coletado em tubos vacutainer EDTA 30 minutos antes da cirurgia, processado 1 h após a coleta e separado por centrifugação a 1.600g por 10 minutos, transferido para tubos de microcentrífuga e centrifugado a 20.000g por 10 minutos para remover os detritos celulares. Tanto o plasma quanto os glóbulos brancos foram coletados e armazenados a -80 ℃ até o uso.

DNA genômico e extração de cfDNA:

O DNA genômico de tecidos tumorais e leucócitos foi extraído pelo kit DNeasy Tissue ou Blood (Qiagen) e, em seguida, fragmentado em um tamanho variando de 200 a 400 pb usando o Covaris S2 SonoLAB (Covaris). O cfDNA foi isolado de 3-5 mL de plasma de cada paciente usando o kit QIAamp Circulating Nucleic Acid (Qiagen). O DNA foi extraído de acordo com as instruções do fabricante, quantificado por um fluorômetro Qubit (Life Technologies) e mantido a -80℃ até o uso.

Sequenciamento completo do exoma:

1μg de DNA por amostra foi usado como material de entrada para a preparação da biblioteca de DNA. A biblioteca de sequenciamento foi gerada usando o sistema de enriquecimento de alvos SureSelect XT para biblioteca de sequenciamento emparelhado Illumina (Agilent) e os códigos de índice foram adicionados a cada amostra. As amostras de DNA genômico foram fragmentadas por sonicação para um tamanho médio de ~ 400bp. Os fragmentos de DNA foram polidos nas extremidades, atados e ligados com o adaptador de comprimento total para sequenciamento, seguido de amplificação por PCR. As bibliotecas foram analisadas quanto à distribuição de tamanho usando um Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent). O agrupamento das amostras codificadas por índice foi realizado usando um cBot Cluster Generation System (Illumina) de acordo com as instruções do fabricante. Após a geração do cluster, as bibliotecas de DNA foram sequenciadas na plataforma Illumina HiSeq 2000 e foram geradas leituras de sequenciamento multiplex de 2 × 100 nt de extremidade pareada.

Sequenciamento de próxima geração de genes direcionados:

No sequenciamento direcionado de tecidos HCC com o painel comercial de 123 genes, 100 ng de DNA genômico fragmentado foram usados ​​para a construção da biblioteca NGS, e sondas abrangendo as sequências de codificação de 123 genes frequentemente mutados em HCC foram usadas para captura de genes direcionados (Baodeng Bio) (Tabela Complementar 1). A biblioteca NGS foi sequenciada com 100 bp paired-end execuções em um sistema Illumina HiSeq 2000 (Illumina). A profundidade média de cobertura para todas as sondas foi de pelo menos 1000 ×.

No sequenciamento direcionado de WBCs com MVI-PG37, 100 ng de DNA genômico fragmentado foram usados ​​para construção de biblioteca NGS usando um kit de construção de biblioteca de sequenciamento KAPA (Kapa Biosystems). A biblioteca de DNA genômico NGS foi então capturada pelo painel Accu-Act (AccuraGen) e sequenciada com 100 bp paired-end runs em um sistema Illumina HiSeq 2500 (Illumina). A profundidade média de cobertura para todas as sondas foi de pelo menos 500 ×.

No sequenciamento direcionado de cfDNA com o painel MVI-PG37, a avaliação baseada em NGS foi realizada usando a plataforma Firefly (AccuraGen) conforme relatado anteriormente13. As bibliotecas NGS foram sequenciadas em um sistema Illumina Hi-Seq 2500 (Illumina), e as leituras de sequenciamento únicas foram determinadas usando um algoritmo proprietário AccuraGen. A profundidade média de cobertura para todas as sondas foi de aproximadamente 7000×.

Análise Bioinformática para os Dados WES e NGS:

Todos os dados de sequenciamento foram alinhados com a sequência de referência humana hg19/GRCh37. Para dados de WES, mutações somáticas incluindo SNPs e indels foram identificadas pelo algoritmo MuTect2. O MOAF para cada gene mutado somático foi calculado para rastrear genes relacionados a MVI usando análise de regressão logística, e genes com um valor de P < 0,1 foram selecionados como candidatos para gerar o painel de genes para posterior sequenciamento de cfDNA. Genes mutados de mutações germinativas foram identificados usando o algoritmo MutSigCV com uma taxa de descoberta falsa (FDR) de <0,001 como corte em HCC com ou sem MVI e, em seguida, foram incluídos na análise de enriquecimento com base no banco de dados GO e KEGG. Os genes mutados das categorias GO/KEGG mais significativamente enriquecidas foram focados, SNPs e indels dessas vias foram incluídos na análise de regressão logística para detectar SNPs e indels associados a MVI com um valor de P < 0,05. Genes contendo SNPs e indels significativos foram selecionados como candidatos do painel de genes.

Para dados de sequenciamento direcionados de tecidos com o painel comercial de 123 genes, as mutações foram identificadas pelo algoritmo MuTect2. Os genes mutantes foram identificados usando o algoritmo MutSigCV com um FDR <0,05 como limite. O MOAF de cada gene mutado foi calculado para rastrear genes relacionados a MVI usando o modelo de regressão logística com um valor de P <0,05 como ponto de corte.

Para dados de sequenciamento direcionados de cfDNA e WBCs, o ruído de fundo introduzido por erro NGS aleatório foi removido pelo algoritmo proprietário AccuraGen. O cfDNA e os dados de sequenciamento de DNA genômico do tumor foram cruzados com a mutação da linhagem germinativa do DNA genômico de WBCs para identificar mutações somáticas. O MOAF foi calculado para cada gene mutado somático e usado como assinaturas somáticas. O status (sim/não) de cada SNP/indel da linha germinativa foi usado como uma assinatura da linha germinal.

Identificação de assinaturas genômicas relacionadas ao MVI no cfDNA:

Para detectar assinaturas genômicas relacionadas a MVI em cfDNA, as assinaturas incluindo MOAF de genes somáticos e status (sim/não) de mutações germinativas foram submetidas ao modelo de regressão logística univariada. As assinaturas com um valor de P <0,1 foram usadas para a seleção multivariada progressiva usando o critério do índice de concordância máxima (índice C).

Para avaliar de forma precisa e conveniente o desempenho das assinaturas relacionadas ao MVI identificadas na previsão do MVI, as assinaturas genômicas relacionadas ao MVI foram usadas para construir uma pontuação baseada em cfDNA usando os coeficientes ponderados pela análise de regressão logística multivariada.

Estabelecimento de um nomograma para prever MVI O modelo de nomograma para prever MVI foi desenvolvido usando a pontuação baseada em cfDNA e variáveis ​​clínicas pré-operatórias associadas com MVI em análises de regressão logística univariada e multivariada na coorte de treinamento. Análise de regressão logística e máquina de vetores de suporte foram usadas para construir o modelo. A análise da curva de decisão (DCA) foi usada para comparar o desempenho entre esses dois algoritmos de aprendizado de máquina. O pacote rms do software R foi utilizado para formular o nomograma. O desempenho do modelo foi avaliado pelo índice de concordância (C-index) e curva de calibração. A validação interna para o desempenho do modelo foi feita usando validação cruzada leave-one-out (LOO) na coorte de treinamento, e a validação externa foi realizada usando dados multicêntricos.

Desenvolvimento de um sistema de reestadiamento para HCC em estágio inicial A pontuação total do nomograma de cada paciente foi calculada e a análise da curva ROC (receiver operating features) foi usada para calcular o valor de corte ideal do nomograma para distinguir entre alto e baixo risco para MVI maximizando o índice de Youden (isto é, sensibilidade+especificidade-1). A precisão do valor de corte foi confirmada pela sensibilidade, especificidade e valores preditivos positivos e negativos. Usando esse valor de corte, os pacientes com CHC em estágio inicial foram estratificados em dois subestágios com alto ou baixo risco previsto por nonograma para MVI, respectivamente.

Análise estatística:

Os desfechos clínicos incluíram sobrevida livre de recorrência (RFS), que foi definida como o tempo desde a cirurgia até o primeiro diagnóstico de recorrência ou morte do paciente sem recorrência; a sobrevida global (SG) foi definida como o tempo desde a cirurgia até a morte do paciente por qualquer causa ou o último acompanhamento; e recorrência local foi definida como qualquer recorrência localizada dentro de 2 cm da margem de ressecção cirúrgica. Os resultados de sobrevida foram estimados usando o método de Kaplan-Meier e o teste de log-rank. O modelo de riscos proporcionais de Cox foi usado para identificar fatores prognósticos independentes. Um valor de P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo, a menos que especificado de outra forma. A análise estatística foi realizada usando a linguagem de programação python versão 2.7 (https://www.python.org/) e o software R versão 3.1.1 (http://www.r-project.org/).