Vaskulære invasionssignaturer i cfDNA understøtter re-stadie af leverkræft

Studere design:

De genetiske profiler, der er forbundet med MVI i tidligt stadium af HCC, blev detekteret for at generere et genpanel baseret på WES og målrettede gen-NGS-data for parrede tumor- og ikke-tumorvæv. Derefter blev genomiske ændringer relateret til MVI i præoperativ cfDNA identificeret ved hjælp af målrettet sekventering med panelet. Baseret på de genomiske signaturer i cfDNA blev en nomogrammodel konstrueret til at forudsige MVI-risici præoperativt, og et re-stadieparadigme for tidligt stadium af HCC baseret på forudsagt høj eller lav risiko for MVI af nomogrammet blev efterfølgende udviklet. Endvidere blev den kliniske relevans af re-stadiesystemet i beslutningen om det optimale omfang af kirurgisk resektion for HCC undersøgt. Denne undersøgelse blev godkendt af den institutionelle etiske komité for hvert center, og der blev opnået informeret samtykke fra alle patienter til, at deres væv eller blodprøver og kliniske data blev brugt til forskningsformål.

Patienter, kirurgisk behandling og opfølgning:

Berettigelseskriterierne var patienter i alderen 18-75 år, histopatologisk bekræftet HCC, tumor inden for Milano-kriterierne, Child-Pugh klasse A for leverfunktion, ingen historie med andre maligne sygdomme, ingen tidligere anti-cancer behandling inklusive neoadjuverende terapi før operation, helbredende- intentionskirurgisk resektion defineret som fuldstændig fjernelse af makroskopiske knuder med mikroskopiske tumorfrie resektionsmarginer og uden fjernmetastaser og større vaskulær invasion, og komplette klinisk-patologiske og opfølgningsdata.

I alt 436 patienter, der gennemgik kirurgisk resektion for HCC i tidligt stadium mellem juni 2015 og december 2017 og opfyldte berettigelseskriterierne, blev prospektivt indsamlet. Af disse patienter fungerede 150 patienter, der blev opereret mellem juni 2015 og maj 2016 på Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital (EHBH), som panelopdagelseskohorten. Parret tumor og tilstødende ikke-tumorvæv fra 81 patienter blev brugt til WES, og dem fra yderligere 69 patienter var til målrettet gen-NGS ved at bruge et kommercielt 123-gen-panel til at detektere MVI-relaterede mutationer.

Yderligere 286 patienter, der blev opereret mellem juni 2016 og december 2017 på multicentre, blev brugt til cfDNA-testning. Perifere blodprøver fra disse patienter blev indsamlet 30 minutter før operationen for at udtrække cfDNA. Ud over konventionel præoperativ vurdering blev volumetrisk vurdering for fremtidig leverrester (FLR) udført ved hjælp af tredimensionel rekonstruktion af billeddannelsesstudier. Alle resektioner blev udført med en intention om fuldstændig fjernelse af tumorknude(r) med enten anatomiske eller ikke-anatomiske resektioner. Bredden af ​​kirurgisk resektionsmargin blev i sidste ende besluttet af de opererende kirurger baseret på tumorstørrelse, tumorantal, intrahepatisk placering, lokale invasive træk ved tumor på billeddiagnostiske undersøgelser, cirrhose, estimeret volumen af ​​FLR, leverfunktion og patienters generelle tilstand som tidligere rapporteret , samt om kirurgens erfaring som et studie om praksis i den virkelige verden. Patienterne blev fulgt op regelmæssigt efter operationen. Tumortilbagefald/metastase blev defineret som fremkomsten af ​​ny(e) læsion(er) bekræftet på mindst to radiologiske billeddannelsesteknikker, med eller uden forhøjelse af serumtumormarkører.

Blandt disse 286 patienter omfattede 125 fra EHBH træningskohorten til at identificere genomiske træk forbundet med MVI i cfDNA og til at udvikle en MVI-forudsigelsesmodel, mens de resterende 161 patienter fra multicentre (Zhongda Hospital of Southeast University, Nanjing; Sun Yat -Sen Memory Hospital fra Sun Yat-Sun University, Guangzhou; Mengchao Hepatobiliary Surgery Hospital ved Fujian Medical University, Fuzhou; og EHBH, Shanghai) fungerede som den eksterne valideringskohorte til at verificere modellens ydeevne.

Præoperative kliniske variabler:

Både genomiske signaturer relateret til MVI i cfDNA og præoperative kliniske variabler, som muligvis var forbundet med MVI, blev brugt til at identificere uafhængige risikofaktorer for MVI for at udvikle den MVI-forudsigelsesmodel. De præoperative kliniske variabler omfattede alder, køn, total bilirubin (TBIL), alaninaminotransferase (ALT), aspartataminotransferase (AST), albumin, blodplader, protrombintid (PT), α-fetoprotein (AFP), protrombin induceret af vitamin K fravær -II (PIVKA-II), hepatitis B- og C-serologi, HBV-DNA-niveauer og billeddannende funktioner såsom tumorantal, tumordiameter og cirrose på præoperativ kontrastforstærket CT-scanning og/eller magnetisk resonansbilleddannelse (MRI).

Histopatologisk diagnose af MVI:

Kirurgisk resekerede prøver blev rutinemæssigt undersøgt histopatologisk efter operationen. For at sikre kvaliteten af ​​vævsprøver ved påvisning af MVI blev der brugt en prøvetagningsprotokol med syv steder anbefalet af Pathology Branch of the Chinese Medical Society (CMS). Sektioner af tumor- og ikke-tumor-levervæv blev undersøgt for at observere tilstedeværelsen af ​​MVI. Histopatologisk diagnose af MVI var på linje med tidligere rapporter. Kort fortalt blev MVI identificeret, hvis der var en mikrovaskulær canceremboli eller cancercellebo i små grene af portvenen eller levervenen i det tilstødende levervæv eller i store kapselkar foret med endotel, som kun var synligt ved mikroskopi. De samme kriterier for den histopatologiske diagnose af MVI blev brugt i hvert center. Bredden af ​​kirurgisk resektionsmargin blev defineret som den nærmeste afstand mellem den rå overflade efter leverresektion og tumorkapslen. Alle histopatologiske undersøgelser blev uafhængigt udført af tre patologer, som nåede frem til en konsensus ved diskussion, hvis der var nogen kontrovers.

Vurdering af egnethed til både bred- og smalmarginresektioner Blandt de 286 patienter blev patienter, der havde gennemgået en smalmarginresektion, revurderet postoperativt for at afgøre, om de også var egnede til en bredmarginresektion. Tre overordnede leverkirurger, som var blindet for de prognostiske oplysninger, gennemgik de præoperative data for disse patienter. Baseret på billeddannelsesegenskaber, herunder tumorstørrelse, tumorantal, tumorkapselstatus, intrahepatisk placering af tumor, estimeret volumen af ​​FLR4, grad af cirrhose, leverfunktion, generel ydeevne samt deres egen kirurgiske erfaring. Vurderingen var baseret på teknisk gennemførlighed og kirurgisk sikkerhed.

Vævs- og blodprøver:

Friske vævsprøver blev opsamlet og opbevaret ved -80 ℃ indtil brug. Perifert blod (10 ml pr. prøve) blev opsamlet i EDTA-vakutainerrør inden for 30 minutter før operation, behandlet inden for 1 time efter opsamling og adskilt ved centrifugering ved 1.600 g i 10 minutter, overført til mikrocentrifugerør og centrifugeret ved 20.000 g i 10 minutter. minutter for at fjerne cellerester. Både plasma og WBC'er blev opsamlet og opbevaret ved -80 ℃ indtil brug.

Genomisk DNA og cfDNA-ekstraktion:

Genomisk DNA fra tumorvæv og WBC'er blev ekstraheret af DNeasy Tissue eller Blood Kit (Qiagen) og derefter fragmenteret til en størrelse i området fra 200 til 400 bp under anvendelse af Covaris S2 SonoLAB (Covaris). cfDNA blev isoleret fra 3-5 ml plasma fra hver patient under anvendelse af QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen). DNA blev ekstraheret i henhold til producentens anvisninger, kvantificeret med et Qubit fluorometer (Life Technologies) og holdt ved -80 ℃ indtil brug.

Hel-eksom-sekventering:

1 μg DNA pr. prøve blev brugt som inputmateriale til DNA-biblioteksforberedelse. Sekvenseringsbiblioteket blev genereret ved hjælp af SureSelect XT Target Enrichment System for Illumina Paired-End Sequencing Library (Agilent), og indekskoder blev tilføjet til hver prøve. De genomiske DNA-prøver blev fragmenteret ved sonikering til en gennemsnitlig størrelse på ~ 400 bp. DNA-fragmenterne blev endepoleret, a-halede og ligeret med fuldlængde-adapteren til sekventering efterfulgt af PCR-amplifikation. Bibliotekerne blev analyseret for størrelsesfordeling under anvendelse af en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent). Klyngningen af ​​de indekskodede prøver blev udført under anvendelse af et cBot Cluster Generation System (Illumina) i henhold til producentens instruktioner. Efter klyngegenerering blev DNA-biblioteker sekventeret på Illumina HiSeq 2000-platformen, og der blev genereret par-ende 2×100 nt multiplex-sekventeringslæsninger.

Målrettet gen næste generations sekvensering:

I målrettet sekventering af HCC-væv med det kommercielle 123-gen-panel blev 100 ng fragmenteret genomisk DNA brugt til NGS-bibliotekskonstruktion, og prober, der spænder over de kodende sekvenser af 123 gener, der ofte er muteret i HCC, blev brugt til målrettet genindfangning (Baodeng Bio) (Supplerende tabel 1). NGS-bibliotek blev sekventeret med 100 bp parrede ende-kørsler på et Illumina HiSeq 2000-system (Illumina). Den gennemsnitlige dækningsdybde for alle sonder var mindst 1000×.

I målrettet sekventering af WBC'er med MVI-PG37 blev 100 ng fragmenteret genomisk DNA brugt til NGS-bibliotekskonstruktion under anvendelse af et KAPA-sekventeringsbibliotekskonstruktionskit (Kapa Biosystems). Genomisk DNA NGS-bibliotek blev derefter fanget af Accu-Act-panelet (AccuraGen) og blev sekventeret med 100 bp parrede ende-kørsler på et Illumina HiSeq 2500-system (Illumina). Den gennemsnitlige dækningsdybde for alle sonder var mindst 500×.

I målrettet sekventering af cfDNA med MVI-PG37-panelet blev NGS-baseret vurdering udført ved hjælp af Firefly-platformen (AccuraGen) som tidligere rapporteret13. NGS-biblioteker blev sekventeret på et Illumina Hi-Seq 2500-system (Illumina), og de unikke sekventeringslæsninger blev bestemt ved hjælp af en proprietær AccuraGen-algoritme. Den gennemsnitlige dækningsdybde for alle sonder var ca. 7000×.

Bioinformatikanalyse for WES- og NGS-data:

Alle sekventeringsdata blev justeret til den humane hg19/GRCh37-referencesekvens. For WES-data blev somatiske mutationer inklusive SNP'er og indels identificeret ved MuTect2-algoritme. MOAF for hvert somatisk muteret gen blev beregnet til at screene MVI-relaterede gener ved hjælp af logistisk regressionsanalyse, og gener med en P-værdi på < 0,1 blev udvalgt som kandidater til at generere genpanelet til yderligere sekventering af cfDNA. Muterede gener af kimlinjemutationer blev identificeret ved hjælp af MutSigCV-algoritmen med en falsk opdagelsesrate (FDR) på <0,001 som cut-off i HCC med eller uden MVI, og blev derefter inkluderet i berigelsesanalyse baseret på GO- og KEGG-databasen. De muterede gener fra de mest signifikant berigede GO/KEGG-kategorier blev fokuseret, SNP'er og indels fra disse veje blev inkluderet i logistisk regressionsanalyse for at detektere SNP'er og indels forbundet med MVI med en P-værdi på < 0,05. Gener indeholdende signifikante SNP'er og indels blev udvalgt som kandidater til genpanelet.

For målrettede sekventeringsdata af væv med det kommercielle 123-gen-panel blev mutationer identificeret af MuTect2-algoritmen. Muterede gener blev identificeret ved hjælp af MutSigCV-algoritmen med en FDR på <0,05 som cut-off. MOAF af hvert muteret gen blev beregnet for at screene MVI-relaterede gener ved hjælp af den logistiske regressionsmodel med en P-værdi på <0,05 som cutoff.

For målrettede sekventeringsdata for cfDNA og WBC'er blev baggrundsstøj introduceret af tilfældig NGS-fejl fjernet af AccuraGen proprietære algoritme. cfDNA- og tumorgenomiske DNA-sekventeringsdata blev krydstjekket med kimlinjemutation fra WBCs genomiske DNA for at identificere somatiske mutationer. MOAF blev beregnet for hvert somatisk muteret gen og brugt som somatiske signaturer. Status (ja/nej) for hver kimlinje SNP/indel blev brugt som en kimlinjesignatur.

Identifikation af genomiske signaturer relateret til MVI i cfDNA:

For at detektere MVI-relaterede genomiske signaturer i cfDNA blev signaturerne inklusive MOAF af somatiske gener og status (ja/nej) af kimlinjemutationer underkastet den univariate logistiske regressionsmodel. Signaturer med en P-værdi på <0,1 blev brugt til den fremadgående trinvise multivariate udvælgelse under anvendelse af det maksimale konkordansindeks (C-indeks) kriteriet.

For nøjagtigt og bekvemt at vurdere ydeevnen af ​​de identificerede MVI-relaterede signaturer til at forudsige MVI, blev de MVI-relaterede genomiske signaturer brugt til at konstruere en cfDNA-baseret score ved hjælp af koefficienterne vægtet af den multivariate logistiske regressionsanalyse.

Etablering af et nomogram til at forudsige MVI Nomogrammodellen til at forudsige MVI blev udviklet ved hjælp af den cfDNA-baserede score og præoperative kliniske variabler forbundet med MVI på univariate og multivariate logistiske regressionsanalyser i træningskohorten. Logistisk regressionsanalyse og støttevektormaskine blev brugt til at konstruere modellen. Beslutningskurveanalyse (DCA) blev brugt til at sammenligne ydeevnen mellem disse to maskinlæringsalgoritmer. rms-pakken med R-software blev brugt til at formulere nomogrammet. Modellens ydeevne blev vurderet ved konkordansindeks (C-indeks) og kalibreringskurve. Intern validering for modellens præstation blev udført ved brug af leave-one-out (LOO) krydsvalidering i træningskohorten, og ekstern validering blev udført ved hjælp af multicenterdata.

Udvikling af et re-staging-system for tidligt stadium HCC Den samlede nomogramscore for hver patient blev beregnet, og receiver operation characteristic (ROC) kurveanalyse blev brugt til at beregne nomogrammets optimale cutoff-værdi for at skelne mellem høj og lav risiko for MVI ved at maksimere Youden-indekset (dvs. sensitivitet+specificitet-1). Nøjagtigheden af ​​afskæringsværdien blev bekræftet af sensitivitet, specificitet og positive og negative prædiktive værdier. Ved at bruge denne afskæringsværdi blev patienter med HCC i tidligt stadium stratificeret i to understadier med henholdsvis nonogram-forudsagt høj eller lav risiko for MVI.

Statistisk analyse:

De kliniske endepunkter omfattede recidivfri overlevelse (RFS), som blev defineret som tiden fra operation til den første diagnose af recidiv eller patientdød uden recidiv; samlet overlevelse (OS) blev defineret som tiden fra operation til patientens død af enhver årsag eller sidste opfølgning; og lokalt recidiv blev defineret som ethvert recidiv lokaliseret inden for 2 cm fra den kirurgiske resektionsmargin. Overlevelsesresultater blev estimeret ved hjælp af Kaplan-Meier-metoden og log-rank test. Cox proportional hazards-modellen blev brugt til at identificere uafhængige prognostiske faktorer. En P-værdi på < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant, medmindre andet er angivet. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af python-programmeringssproget version 2.7 (https://www.python.org/) og R-softwareversion 3.1.1 (http://www.r-project.org/).