CfDNA의 혈관 침습 시그니처는 간암의 병기 재결정을 지원합니다.

연구 설계:

초기 단계의 HCC에서 MVI와 관련된 유전적 프로파일은 쌍을 이룬 종양 및 비종양 조직의 WES 및 표적 유전자 NGS 데이터를 기반으로 유전자 패널을 생성하는 것으로 검출되었습니다. 그런 다음 수술 전 cfDNA에서 MVI와 관련된 게놈 교대를 패널의 표적 시퀀싱을 사용하여 확인했습니다. cfDNA의 게놈 서명을 기반으로 수술 전 MVI 위험을 예측하기 위해 노모그램 모델을 구성했으며, 이후 노모그램에 의해 예측된 고위험 또는 저위험 MVI를 기반으로 초기 간세포암종에 대한 재병기 패러다임이 개발되었습니다. 또한 간세포암종에 대한 수술적 절제의 최적 범위를 결정하는 재병기결정 시스템의 임상적 관련성을 조사하였다. 본 연구는 각 센터의 기관윤리위원회의 승인을 받았으며, 연구 목적으로 사용하기 위해 모든 환자로부터 조직 또는 혈액 샘플 및 임상 데이터에 대한 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.

환자, 외과적 치료 및 후속 조치:

적격 기준은 18-75세의 환자, 조직병리학적으로 확인된 간세포암종, 밀란 기준 내의 종양, 간 기능의 Child-Pugh 클래스 A, 다른 악성 종양의 병력 없음, 수술 전 신보조 요법을 포함한 이전 항암 치료 없음, 완치- 의도적 수술적 절제는 미세한 종양이 없는 절제연이 있고 원격 전이 및 주요 혈관 침범이 없는 거시적 결절의 완전한 제거와 완전한 임상병리학적 및 추적 데이터로 정의됩니다.

2015년 6월부터 2017년 12월까지 초기 간세포암종으로 외과적 절제술을 시행하고 적격 기준을 충족한 총 436명의 환자를 전향적으로 수집하였다. 이 중 2015년 6월부터 2016년 5월까지 EHBH(Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital)에서 수술을 받은 환자 150명이 패널 디스커버리 코호트로 참여했다. 81명의 환자로부터 쌍을 이룬 종양 및 인접한 비종양 조직이 WES에 사용되었고, 다른 69명의 환자로부터의 것이 MVI 관련 돌연변이를 검출하기 위해 상업적인 123개 유전자 패널을 사용하여 표적 유전자 NGS에 사용되었습니다.

2016년 6월부터 2017년 12월까지 다기관에서 수술을 받은 또 다른 286명의 환자가 cfDNA 테스트에 사용되었습니다. cfDNA를 추출하기 위해 수술 30분 전에 이들 환자의 말초 혈액 샘플을 수집했습니다. 기존의 수술 전 평가 외에도 미래의 남은 간(FLR)에 대한 체적 평가가 영상 연구의 3차원 재구성을 사용하여 수행되었습니다. 모든 절제는 해부학적 또는 비-해부학적 절제로 종양 결절을 완전히 제거하려는 의도로 수행되었습니다. 수술 절제연의 폭은 이전에보고 된 바와 같이 종양 크기, 종양 수, 간내 위치, 영상 연구에서 종양의 국소 침습적 특징, 간경변, FLR 추정 부피, 간 기능 및 환자의 일반적인 상태를 기반으로 수술 외과 의사에 의해 궁극적으로 결정되었습니다. , 뿐만 아니라 실제 연습에 대한 연구로서 외과 의사의 경험에. 환자들은 수술 후 정기적으로 추적관찰을 받았다. 종양 재발/전이는 혈청 종양 표지자의 상승 여부에 관계없이 적어도 두 가지 방사선 영상 기술에서 확인된 새로운 병변의 출현으로 정의되었습니다.

이 286명의 환자 중 EHBH의 125명은 cfDNA에서 MVI와 관련된 게놈 특징을 식별하고 MVI 예측 모델을 개발하기 위한 훈련 코호트로 구성되었으며, 나머지 161명의 다기관 환자(난징 동남 대학교 종다 병원, Sun Yat)는 -광저우 Sun Yat-Sun University의 Sen Memory 병원, Fuzhou의 Fujian Medical University의 Mengchao Hepatobiliary Surgery Hospital, 상하이의 EHBH)는 모델 성능을 검증하기 위한 외부 검증 코호트로 사용되었습니다.

수술 전 임상 변수:

cfDNA의 MVI와 관련된 게놈 서명과 MVI와 관련되었을 가능성이 있는 수술 전 임상 변수는 MVI 예측 모델을 개발하기 위해 MVI의 독립적인 위험 요인을 식별하는 데 사용되었습니다. 수술 전 임상 변수에는 연령, 성별, 총 빌리루빈(TBIL), 알라닌 아미노전이효소(ALT), 아스파르테이트 아미노전이효소(AST), 알부민, 혈소판, 프로트롬빈 시간(PT), α-태아단백(AFP), 비타민 K 결핍으로 유발된 프로트롬빈이 포함되었습니다. -II(PIVKA-II), B형 간염 및 C형 간염 혈청학, HBV-DNA 수준, 수술 전 조영 증강 CT 스캔 및/또는 자기 공명 영상(MRI)에서 종양 수, 종양 직경 및 간경변과 같은 영상 특징.

MVI의 조직병리학적 진단:

수술로 절제된 표본은 수술 후 조직병리학적으로 일상적으로 검사되었습니다. MVI 검출 시 조직 샘플의 품질을 보장하기 위해 CMS(Chinese Medical Society)의 병리 분과에서 권장하는 7개 사이트 샘플링 프로토콜이 사용되었습니다. 종양 및 비종양 간 조직의 절편을 검사하여 MVI의 존재를 관찰했습니다. MVI의 조직병리학적 진단은 이전 보고서와 일치했습니다. 간단히 말해서, MVI는 인접한 간 조직의 간문맥 또는 간정맥의 작은 가지에 미세혈관 암 색전 또는 암 세포 둥지가 있거나 현미경에서만 볼 수 있는 내피가 늘어선 큰 캡슐 혈관에 있는 경우 식별되었습니다. MVI의 조직병리학적 진단에 대한 동일한 기준이 각 센터에서 사용되었습니다. 외과적 절제연의 폭은 간절제 후 표면과 종양 피막 사이의 가장 가까운 거리로 정의하였다. 모든 조직병리학적 연구는 논란이 있을 경우 논의를 통해 합의에 도달한 3명의 병리학자에 의해 독립적으로 수행되었다.

넓은 절제면 절제술과 좁은 절제면 절제술 모두에 대한 적합성 평가 286명의 환자 중 좁은 절제면 절제술을 받은 환자를 수술 후 넓은 절제면 절제술에 적합한지 여부를 재평가했습니다. 예후 정보에 대해 알지 못하는 세 명의 수석 간외과 의사가 이 환자들의 수술 전 데이터를 검토했습니다. 종양 크기, 종양 수, 종양 피막 상태, 종양의 간내 위치, FLR4의 추정 부피, 간경화 정도, 간 기능, 일반적인 성능 및 자신의 수술 경험을 포함한 영상 특징을 기반으로 합니다. 평가는 기술적 타당성과 수술 안전성을 기반으로 했습니다.

조직 및 혈액 샘플:

신선한 조직 샘플을 채취하여 사용할 때까지 -80℃에서 보관했습니다. 말초혈액(시료당 10 mL)을 수술 전 30분 이내에 EDTA vacutainer tube에 채취하여 채취 1시간 이내에 처리하고 1,600g에서 10분간 원심분리하여 분리한 후 microcentrifuge tube에 옮겨 20,000g에서 10분간 원심분리하였다. 세포 파편을 제거하는 분. 혈장과 백혈구 모두 채취하여 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.

게놈 DNA 및 cfDNA 추출:

종양 조직 및 WBC의 게놈 DNA를 DNeasy Tissue or Blood Kit(Qiagen)로 추출한 다음 Covaris S2 SonoLAB(Covaris)를 사용하여 200~400bp 크기로 단편화했습니다. QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen)를 사용하여 각 환자의 혈장 3~5mL에서 cfDNA를 분리했습니다. 제조사의 지시에 따라 DNA를 추출하여 Qubit fluorometer(Life Technologies)로 정량하고 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.

전체 엑솜 시퀀싱:

샘플당 1μg의 DNA를 DNA 라이브러리 준비를 위한 입력 물질로 사용했습니다. Illumina Paired-End Sequencing Library(Agilent)용 SureSelect XT Target Enrichment System을 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 생성하고 인덱스 코드를 각 샘플에 추가했습니다. 게놈 DNA 샘플은 ~400bp의 평균 크기로 초음파 처리에 의해 단편화되었습니다. DNA 절편을 말단 연마하고, 꼬리를 꼬리로 하고 시퀀싱을 위해 전체 길이 어댑터로 결찰한 다음 PCR 증폭을 수행했습니다. 라이브러리는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent)를 사용하여 크기 분포에 대해 분석되었습니다. 색인 코딩된 샘플의 클러스터링은 제조업체의 지침에 따라 cBot 클러스터 생성 시스템(Illumina)을 사용하여 수행되었습니다. 클러스터 생성 후 Illumina HiSeq 2000 플랫폼에서 DNA 라이브러리를 시퀀싱하고 페어드 엔드 2×100nt 멀티플렉스 시퀀싱 판독을 생성했습니다.

표적 유전자 차세대 시퀀싱:

상용화된 123-gene-panel을 이용한 HCC 조직의 표적 시퀀싱에서, 100ng의 단편화된 게놈 DNA를 NGS 라이브러리 구축에 사용하고, HCC에서 자주 돌연변이되는 123개 유전자의 코딩 서열에 걸친 프로브를 표적 유전자 포획에 사용했습니다(Baodeng Bio). (보충 표 1). NGS 라이브러리는 Illumina HiSeq 2000 시스템(Illumina)에서 100bp 페어드 엔드 실행으로 시퀀싱되었습니다. 모든 프로브의 평균 커버리지 깊이는 1000배 이상이었습니다.

MVI-PG37을 이용한 WBC의 표적 시퀀싱에서 KAPA 시퀀싱 라이브러리 구성 키트(Kapa Biosystems)를 사용하여 100ng의 단편화된 게놈 DNA를 NGS 라이브러리 구성에 사용했습니다. 그런 다음 게놈 DNA NGS 라이브러리를 Accu-Act 패널(AccuraGen)로 캡처하고 Illumina HiSeq 2500 시스템(Illumina)에서 100bp 쌍방향 실행으로 시퀀싱했습니다. 모든 프로브의 평균 커버리지 깊이는 500배 이상이었습니다.

MVI-PG37 패널을 사용한 cfDNA의 표적 시퀀싱에서 NGS 기반 평가는 이전에 보고된 바와 같이 Firefly 플랫폼(AccuraGen)을 사용하여 수행되었습니다13. NGS 라이브러리는 Illumina Hi-Seq 2500 시스템(Illumina)에서 시퀀싱되었으며 고유한 시퀀싱 읽기는 AccuraGen 독점 알고리즘을 사용하여 결정되었습니다. 모든 프로브의 평균 커버리지 깊이는 약 7000×였습니다.

WES 및 NGS 데이터에 대한 생물정보학 분석:

모든 시퀀싱 데이터는 hg19/GRCh37 인간 참조 서열에 정렬되었습니다. WES 데이터의 경우 SNP 및 indel을 포함한 체세포 돌연변이가 MuTect2 알고리즘으로 식별되었습니다. 각 체세포 돌연변이 유전자에 대한 MOAF를 계산하여 로지스틱 회귀 분석을 사용하여 MVI 관련 유전자를 스크리닝하고 P 값이 0.1 미만인 유전자를 후보로 선택하여 cfDNA의 추가 시퀀싱을 위한 유전자 패널을 생성했습니다. 생식선 돌연변이의 돌연변이 유전자는 MVI 유무에 관계없이 HCC에서 컷오프로 FDR(False Discovery Rate)이 0.001 미만인 MutSigCV 알고리즘을 사용하여 확인된 다음 GO 및 KEGG 데이터베이스를 기반으로 한 농축 분석에 포함되었습니다. 가장 크게 농축된 GO/KEGG 범주의 돌연변이 유전자에 초점을 맞추었고, 이러한 경로의 SNP 및 인델은 P 값이 0.05 미만인 MVI와 관련된 SNP 및 인델을 검출하기 위해 로지스틱 회귀 분석에 포함되었습니다. 중요한 SNP 및 인델을 포함하는 유전자를 유전자 패널의 후보로 선택하였다.

상업적인 123-유전자 패널이 있는 조직의 표적 시퀀싱 데이터의 경우 MuTect2 알고리즘으로 돌연변이를 식별했습니다. FDR이 0.05 미만인 MutSigCV 알고리즘을 컷오프로 사용하여 돌연변이 유전자를 확인했습니다. 각 돌연변이 유전자의 MOAF는 P 값이 0.05 미만인 로지스틱 회귀 모델을 컷오프로 사용하여 MVI 관련 유전자를 스크리닝하기 위해 계산되었습니다.

cfDNA 및 WBC의 표적 시퀀싱 데이터의 경우, AccuraGen 독점 알고리즘에 의해 무작위 NGS 오류로 인해 발생하는 배경 노이즈가 제거되었습니다. cfDNA 및 종양 게놈 DNA 시퀀싱 데이터는 체세포 돌연변이를 식별하기 위해 WBC 게놈 DNA의 생식계열 돌연변이와 교차 확인되었습니다. MOAF는 각 체세포 돌연변이 유전자에 대해 계산되어 체세포 서명으로 사용되었습니다. 각 생식계열 SNP/indel의 상태(예/아니오)를 생식계열 서명으로 사용했습니다.

cfDNA에서 MVI와 관련된 게놈 서명 식별:

cfDNA에서 MVI 관련 게놈 시그니처를 검출하기 위해 체세포 유전자의 MOAF 및 생식계열 돌연변이의 상태(예/아니오)를 포함한 시그니처를 단변량 로지스틱 회귀 모델에 적용했습니다. P 값이 0.1 미만인 시그니처는 최대 일치 지수(C-index) 기준을 사용하여 정방향 단계적 다변량 선택에 사용되었습니다.

MVI를 예측할 때 확인된 MVI 관련 서명의 성능을 정확하고 편리하게 평가하기 위해 MVI 관련 게놈 서명을 사용하여 다변량 로지스틱 회귀 분석에 의해 가중된 계수를 사용하여 cfDNA 기반 점수를 구성했습니다.

MVI를 예측하기 위한 노모그램 설정 MVI를 예측하기 위한 노모그램 모델은 훈련 코호트에서 단변량 및 다변량 로지스틱 회귀 분석에서 MVI와 관련된 cfDNA 기반 점수 및 수술 전 임상 변수를 사용하여 개발되었습니다. 로지스틱 회귀 분석 및 지원 벡터 머신을 사용하여 모델을 구성했습니다. DCA(Decision Curve Analysis)를 사용하여 이 두 기계 학습 알고리즘 간의 성능을 비교했습니다. R 소프트웨어의 rms 패키지는 노모그램을 공식화하는 데 사용되었습니다. 모델 성능은 일치 지수(C-index) 및 검량선으로 평가되었습니다. 모델 성능에 대한 내부 검증은 교육 코호트에서 LOO(leave-one-out) 교차 검증을 사용하여 수행되었으며 외부 검증은 다중 센터 데이터를 사용하여 수행되었습니다.

초기 간세포암종 재병기 시스템 개발 각 환자의 총 노모그램 점수를 계산하고, ROC(수신자 작동 특성) 곡선 분석을 통해 노모그램의 최적 컷오프 값을 계산하여 고위험군과 저위험군을 구분했습니다. Youden 지수(즉, 민감도+특이도-1)를 최대화하여 MVI에 대해. 컷오프 값의 정확성은 민감도, 특이도, 양성 및 음성 예측값으로 확인되었습니다. 이 컷오프 값을 사용하여 초기 HCC 환자를 노노그램으로 예측한 MVI의 고위험군 또는 저위험군으로 각각 2개의 하위 단계로 계층화했습니다.

통계 분석:

임상 종점에는 수술부터 재발의 첫 번째 진단 또는 재발 없는 환자 사망까지의 시간으로 정의되는 무재발 생존(RFS); 전체 생존(OS)은 수술부터 모든 원인으로 인한 환자 사망 또는 마지막 추적 관찰까지의 시간으로 정의되었습니다. 국소 재발은 외과적 절제연의 2cm 이내에 위치한 모든 재발로 정의되었습니다. Kaplan-Meier 방법과 로그 순위 테스트를 사용하여 생존 결과를 추정했습니다. Cox 비례 위험 모델은 독립적인 예후 인자를 식별하는 데 사용되었습니다. 0.05 미만의 P 값은 달리 명시되지 않는 한 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 통계 분석은 Python 프로그래밍 언어 버전 2.7(https://www.python.org/)을 사용하여 수행되었습니다. 및 R 소프트웨어 버전 3.1.1 (http://www.r-project.org/).