Signatury vaskulární invaze v cfDNA podporují obnovení stádia rakoviny jater

Studovat design:

Genetické profily spojené s MVI v raném stádiu HCC byly detekovány pro vytvoření genového panelu založeného na datech WES a cílených genových NGS spárovaných nádorových a nenádorových tkání. Poté byly pomocí cíleného sekvenování s panelem identifikovány genomové alternace související s MVI v předoperační cfDNA. Na základě genomických signatur v cfDNA byl zkonstruován nomogramový model k předpovědi rizik MVI před operací a následně bylo vyvinuto paradigma změny stadia pro časné stadium HCC založené na předpovědi vysokého nebo nízkého rizika MVI pomocí nomogramu. Dále byla zkoumána klinická relevance systému re-stagingu při rozhodování o optimálním rozsahu chirurgické resekce pro HCC. Tato studie byla schválena Institucionální etickou komisí každého centra a od všech pacientů byl získán informovaný souhlas se vzorky tkání nebo krve a klinickými údaji, které měly být použity pro výzkumné účely.

Pacienti, chirurgická léčba a sledování:

Kritéria způsobilosti byli pacienti ve věku 18-75 let, histopatologicky potvrzený HCC, nádor v rámci milánských kritérií, Child-Pugh třída A jaterních funkcí, bez anamnézy jiných malignit, bez předchozí protinádorové léčby včetně neoadjuvantní terapie před operací, kurativní- záměrná chirurgická resekce definovaná jako kompletní odstranění makroskopických uzlin s mikroskopickými resekčními okraji bez tumoru a bez vzdálených metastáz a velké vaskulární invaze a kompletní klinicko-patologické a následné údaje.

Prospektivně bylo shromážděno celkem 436 pacientů, kteří podstoupili chirurgickou resekci pro časné stadium HCC v období od června 2015 do prosince 2017 a splnili kritéria způsobilosti. Z těchto pacientů 150 pacientů, kteří byli operováni v období od června 2015 do května 2016 ve Východní hepatobiliární chirurgii (EHBH), sloužilo jako panelová skupina. Spárované nádorové a přilehlé nenádorové tkáně od 81 pacientů byly použity pro WES a ty od dalších 69 pacientů byly použity pro cílený gen NGS pomocí komerčního 123-genového panelu k detekci mutací souvisejících s MVI.

Dalších 286 pacientů, kteří podstoupili operaci mezi červnem 2016 a prosincem 2017 v multicentrech, bylo použito k testování cfDNA. Vzorky periferní krve těchto pacientů byly odebrány 30 minut před operací k extrakci cfDNA. Kromě konvenčního předoperačního hodnocení bylo provedeno volumetrické hodnocení budoucího jaterního zbytku (FLR) pomocí trojrozměrné rekonstrukce zobrazovacích studií. Všechny resekce byly provedeny se záměrem úplného odstranění nádorového uzlu (uzlů) buď anatomickými nebo neanatomickými resekcemi. O šířce chirurgického resekčního okraje nakonec rozhodli operující chirurgové na základě velikosti nádoru, počtu nádoru, intrahepatální lokalizace, lokálních invazivních znaků nádoru na zobrazovacích studiích, cirhózy, odhadovaného objemu FLR, jaterních funkcí a celkového stavu pacientů, jak bylo dříve popsáno , stejně jako na zkušenostech chirurga jako studie o praxi v reálném světě. Pacienti byli po operaci pravidelně sledováni. Recidiva/metastázy nádoru byla definována jako objevení se nové léze (lézí) potvrzené alespoň dvěma radiologickými zobrazovacími technikami, s nebo bez zvýšení sérových nádorových markerů.

Mezi těmito 286 pacienty 125 z EHBH tvořilo tréninkovou kohortu pro identifikaci genomových rysů spojených s MVI v cfDNA a při vývoji modelu predikce MVI, zatímco zbývajících 161 pacientů z multicenter (Zhongda Hospital of Southeast University, Nanjing; Sun Yat -Sen Memory Hospital na Sun Yat-Sun University, Guangzhou; Mengchao Hepatobiliary Surgery Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou; a EHBH, Shanghai) sloužily jako externí validační kohorta pro ověření výkonnosti modelu.

Předoperační klinické proměnné:

Jak genomové signatury související s MVI v cfDNA, tak předoperační klinické proměnné, které byly pravděpodobně spojeny s MVI, byly použity při identifikaci nezávislých rizikových faktorů MVI za účelem vytvoření modelu predikce MVI. Předoperační klinické proměnné zahrnovaly věk, pohlaví, celkový bilirubin (TBIL), alaninaminotransferázu (ALT), aspartátaminotransferázu (AST), albumin, krevní destičky, protrombinový čas (PT), α-fetoprotein (AFP), protrombin indukovaný absencí vitaminu K -II (PIVKA-II), sérologie hepatitidy B a C, hladiny HBV-DNA a zobrazovací znaky, jako je počet nádorů, průměr nádoru a cirhóza na předoperačním kontrastním CT skenu a/nebo zobrazení magnetickou rezonancí (MRI).

Histopatologická diagnóza MVI:

Chirurgicky resekované vzorky byly po operaci rutinně vyšetřovány histopatologicky. K zajištění kvality vzorků tkáně při detekci MVI byl použit sedmimístný protokol odběru doporučený oddělením patologie Čínské lékařské společnosti (CMS). Řezy nádorových a nenádorových jaterních tkání byly zkoumány, aby byla pozorována přítomnost MVI. Histopatologická diagnóza MVI byla v souladu s předchozími zprávami. Stručně řečeno, MVI byl identifikován, pokud existovala mikrovaskulární rakovinná embolie nebo hnízdo rakovinných buněk v malých větvích portální žíly nebo jaterní žíly v přilehlých jaterních tkáních nebo ve velkých kapsulárních cévách vystlaných endotelem, které byly viditelné pouze mikroskopicky. V každém centru byla použita stejná kritéria pro histopatologickou diagnózu MVI. Šířka chirurgického resekčního okraje byla definována jako nejbližší vzdálenost mezi nezpracovaným povrchem po resekci jater a pouzdrem nádoru. Všechny histopatologické studie byly nezávisle provedeny třemi patology, kteří dospěli ke konsenzu diskusí, pokud by existovala nějaká kontroverze.

Posouzení vhodnosti pro resekce širokého i úzkého okraje Mezi 286 pacienty byli pacienti, kteří podstoupili resekci s úzkým okrajem, pooperačně znovu posouzeni, aby se zjistilo, zda jsou také vhodní pro resekci širokého okraje. Tři starší jaterní chirurgové, kteří byli zaslepeni vůči prognostickým informacím, přezkoumali předoperační data těchto pacientů. Na základě zobrazovacích znaků včetně velikosti nádoru, počtu nádoru, stavu pouzdra nádoru, intrahepatální lokalizace nádoru, odhadovaného objemu FLR4, stupně cirhózy, jaterních funkcí, celkového výkonu a také vlastních chirurgických zkušeností. Hodnocení bylo založeno na technické proveditelnosti a chirurgické bezpečnosti.

Vzorky tkání a krve:

Vzorky čerstvé tkáně byly odebrány a skladovány při -80 °C až do použití. Periferní krev (10 ml na vzorek) byla odebrána do zkumavek EDTA vacutainer během 30 minut před operací, zpracována do 1 hodiny po odběru a oddělena centrifugací při 1 600 g po dobu 10 minut, přenesena do mikrocentrifugačních zkumavek a centrifugována při 20 000 g po dobu 10 minut. minut k odstranění buněčných zbytků. Plazma i bílé krvinky byly shromážděny a skladovány při -80 °C až do použití.

Extrakce genomové DNA a cfDNA:

Genomová DNA z nádorových tkání a bílých krvinek byla extrahována soupravou DNeasy Tissue or Blood Kit (Qiagen) a poté fragmentována na velikost v rozmezí od 200 do 400 bp pomocí Covaris S2 SonoLAB (Covaris). cfDNA byla izolována z 3-5 ml plazmy každého pacienta pomocí QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen). DNA byla extrahována podle pokynů výrobce, kvantifikována fluorometrem Qubit (Life Technologies) a udržována při -80 °C až do použití.

Sekvenování celého exomu:

Jako vstupní materiál pro přípravu DNA knihovny byl použit 1μg DNA na vzorek. Sekvenační knihovna byla vytvořena pomocí SureSelect XT Target Enrichment System for Illumina Paired-End Sequencing Library (Agilent) a do každého vzorku byly přidány indexové kódy. Vzorky genomové DNA byly fragmentovány sonikací na průměrnou velikost ~ 400 bp. Fragmenty DNA byly zakončeny leštěním, zakončením a a ligovány s adaptérem plné délky pro sekvenování, po čemž následovala PCR amplifikace. Knihovny byly analyzovány na distribuci velikosti pomocí Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent). Shlukování indexově kódovaných vzorků bylo provedeno pomocí cBot Cluster Generation System (Illumina) podle pokynů výrobce. Po vygenerování klastru byly knihovny DNA sekvenovány na platformě Illumina HiSeq 2000 a byly generovány čtení multiplexního sekvenování s 2×100 nt párovým koncem.

Cílené sekvenování genů nové generace:

Při cíleném sekvenování tkání HCC pomocí komerčního 123-genového panelu bylo použito 100 ng fragmentované genomové DNA pro konstrukci knihovny NGS a sondy zahrnující kódující sekvence 123 genů často mutovaných v HCC byly použity pro cílené zachycení genu (Baodeng Bio) (Doplňková tabulka 1). Knihovna NGS byla sekvenována pomocí 100 bp běhů s párovaným koncem na systému Illumina HiSeq 2000 (Illumina). Průměrná hloubka pokrytí pro všechny sondy byla minimálně 1000×.

Při cíleném sekvenování bílých krvinek pomocí MVI-PG37 bylo použito 100 ng fragmentované genomové DNA pro konstrukci knihovny NGS za použití soupravy pro konstrukci sekvenační knihovny KAPA (Kapa Biosystems). Knihovna genomové DNA NGS byla poté zachycena panelem Accu-Act (AccuraGen) a byla sekvenována pomocí 100 bp běhů s párovým koncem na systému Illumina HiSeq 2500 (Illumina). Průměrná hloubka pokrytí pro všechny sondy byla minimálně 500×.

Při cíleném sekvenování cfDNA s panelem MVI-PG37 bylo provedeno hodnocení založené na NGS pomocí platformy Firefly (AccuraGen), jak bylo uvedeno dříve13. Knihovny NGS byly sekvenovány na systému Illumina Hi-Seq 2500 (Illumina) a jedinečné sekvenační čtení byly stanoveny pomocí proprietárního algoritmu AccuraGen. Průměrná hloubka pokrytí pro všechny sondy byla přibližně 7000×.

Bioinformatická analýza pro data WES a NGS:

Všechna sekvenační data byla porovnána s hg19/GRCh37 lidskou referenční sekvencí. Pro data WES byly pomocí algoritmu MuTect2 identifikovány somatické mutace včetně SNP a indelů. MOAF pro každý somaticky mutovaný gen byl vypočten pro screening genů souvisejících s MVI pomocí logistické regresní analýzy a geny s P hodnotou < 0,1 byly vybrány jako kandidáti pro vytvoření genového panelu pro další sekvenování cfDNA. Mutované geny zárodečných mutací byly identifikovány pomocí algoritmu MutSigCV s mírou falešného objevu (FDR) <0,001 jako mezní hodnota v HCC s nebo bez MVI a poté byly zahrnuty do analýzy obohacení založené na databázi GO a KEGG. Byly zaměřeny mutované geny nejvýrazněji obohacených kategorií GO/KEGG, SNP a indely z těchto drah byly zahrnuty do logistické regresní analýzy k detekci SNP a indelů asociovaných s MVI s hodnotou P < 0,05. Geny obsahující významné SNP a indely byly vybrány jako kandidáti genového panelu.

Pro data cíleného sekvenování tkání s komerčním 123-genovým panelem byly mutace identifikovány algoritmem MuTect2. Mutované geny byly identifikovány pomocí algoritmu MutSigCV s FDR <0,05 jako mezní hodnota. MOAF každého mutovaného genu byl vypočítán pro screening genů souvisejících s MVI s použitím modelu logistické regrese s hodnotou P <0,05 jako mezní hodnotou.

Pro data cíleného sekvenování cfDNA a WBC byl šum pozadí zavedený náhodnou chybou NGS odstraněn proprietárním algoritmem AccuraGen. Údaje o sekvenování cfDNA a genomové DNA nádoru byly křížově zkontrolovány s mutací zárodečné linie z genomové DNA bílých krvinek, aby se identifikovaly somatické mutace. MOAF byla vypočtena pro každý somatický mutovaný gen a použita jako somatické signatury. Stav (ano/ne) každé zárodečné linie SNP/indel byl použit jako podpis zárodečné linie.

Identifikace genomických signatur souvisejících s MVI v cfDNA:

Pro detekci genomových signatur souvisejících s MVI v cfDNA byly signatury včetně MOAF somatických genů a stav (ano/ne) zárodečných mutací podrobeny modelu jednorozměrné logistické regrese. Podpisy s hodnotou P <0,1 byly použity pro dopředný krokový vícerozměrný výběr s použitím kritéria maximálního indexu shody (C-index).

Pro přesné a pohodlné posouzení výkonnosti identifikovaných signatur souvisejících s MVI při predikci MVI byly genomové signatury související s MVI použity ke konstrukci skóre založeného na cfDNA pomocí koeficientů vážených multivariační logistickou regresní analýzou.

Vytvoření nomogramu pro predikci MVI Model nomogramu pro predikci MVI byl vyvinut pomocí skóre založeného na cfDNA a předoperačních klinických proměnných spojených s MVI na jednorozměrných a vícerozměrných logistických regresních analýzách v tréninkové kohortě. Pro konstrukci modelu byla použita logistická regresní analýza a podpůrný vektorový stroj. K porovnání výkonu mezi těmito dvěma algoritmy strojového učení byla použita analýza rozhodovací křivky (DCA). K formulaci nomogramu byl použit rms balíček softwaru R. Výkonnost modelu byla hodnocena pomocí indexu shody (C-index) a kalibrační křivky. Interní ověření výkonnosti modelu bylo provedeno pomocí křížové validace vynechání (LOO) v tréninkové kohortě a externí ověření bylo provedeno pomocí multicentrických dat.

Vývoj systému opětovného stagingu pro časnou fázi HCC Bylo vypočteno celkové skóre nomogramu každého pacienta a analýza křivky provozní charakteristiky přijímače (ROC) byla použita k výpočtu optimální hraniční hodnoty nomogramu, aby bylo možné rozlišit mezi vysokým a nízkým rizikem. pro MVI maximalizací Youdenova indexu (tj. citlivost + specificita-1). Přesnost hraniční hodnoty byla potvrzena senzitivitou, specificitou a pozitivními a negativními prediktivními hodnotami. Pomocí této hraniční hodnoty byli pacienti s časným stádiem HCC stratifikováni do dvou dílčích stádií s vysokým nebo nízkým rizikem MVI, které nebylo předpovězeno na základě gramu.

Statistická analýza:

Klinické cílové parametry zahrnovaly přežití bez recidivy (RFS), které bylo definováno jako doba od operace do první diagnózy recidivy nebo úmrtí pacienta bez recidivy; celkové přežití (OS) bylo definováno jako doba od operace do úmrtí pacienta z jakékoli příčiny nebo posledního sledování; a lokální recidiva byla definována jako jakákoli recidiva lokalizovaná do 2 cm od okraje chirurgické resekce. Výsledky přežití byly odhadnuty pomocí Kaplan-Meierovy metody a log-rank testu. K identifikaci nezávislých prognostických faktorů byl použit Coxův model proporcionálních rizik. Hodnota P < 0,05 byla považována za statisticky významnou, pokud není uvedeno jinak. Statistická analýza byla provedena pomocí programovacího jazyka python verze 2.7 (https://www.python.org/) a software R verze 3.1.1 (http://www.r-project.org/).