Сигнатуры сосудистой инвазии во вкДНК поддерживают повторное определение стадии рака печени

Дизайн исследования:

Генетические профили, связанные с MVI на ранней стадии HCC, были обнаружены для создания генной панели на основе данных WES и целевых генов NGS парных опухолевых и неопухолевых тканей. Затем геномные альтерации, связанные с MVI в дооперационной вкДНК, были идентифицированы с помощью целевого секвенирования с панелью. На основе геномных сигнатур во вкДНК была построена модель номограммы для предоперационного прогнозирования рисков МВВ, а затем была разработана парадигма повторного стадирования ГЦК на ранней стадии на основе предсказанного высокого или низкого риска МВВ по номограмме. Кроме того, была изучена клиническая значимость системы повторного стадирования при принятии решения об оптимальной степени хирургической резекции по поводу ГЦР. Это исследование было одобрено Институциональным комитетом по этике каждого центра, и от всех пациентов было получено информированное согласие на использование их образцов тканей или крови и клинических данных в исследовательских целях.

Пациенты, хирургическое лечение и последующее наблюдение:

Критериями отбора были пациенты в возрасте 18-75 лет, гистопатологически подтвержденный ГЦК, опухоль в пределах миланских критериев, класс функции печени А по Чайлд-Пью, отсутствие других злокачественных новообразований в анамнезе, отсутствие предшествующего противоракового лечения, включая неоадъювантную терапию перед операцией, преднамеренная хирургическая резекция, определяемая как полное удаление макроскопических узлов с микроскопическими краями резекции без опухоли, без отдаленных метастазов и крупной сосудистой инвазии, а также с полными клинико-патологическими данными и данными последующего наблюдения.

Всего было проспективно отобрано 436 пациентов, перенесших хирургическую резекцию ГЦК на ранней стадии в период с июня 2015 г. по декабрь 2017 г. и отвечающих критериям включения. Из этих пациентов 150 пациентов, которые были прооперированы в период с июня 2015 г. по май 2016 г. в Восточной больнице гепатобилиарной хирургии (EHBH), служили когортой исследования. Парные опухоли и прилегающие неопухолевые ткани от 81 пациента были использованы для WES, а ткани еще 69 пациентов были использованы для целевого гена NGS с использованием коммерческой панели из 123 генов для обнаружения мутаций, связанных с MVI.

Еще 286 пациентов, перенесших операцию в период с июня 2016 г. по декабрь 2017 г. в мультицентрах, были использованы для тестирования вкДНК. Образцы периферической крови этих пациентов были собраны за 30 минут до операции для извлечения вкДНК. В дополнение к обычной предоперационной оценке объемная оценка будущего остатка печени (FLR) выполнялась с использованием трехмерной реконструкции исследований изображений. Все резекции были выполнены с целью полного удаления опухолевого узла (узлов) с анатомической или неанатомической резекцией. Ширина хирургического края резекции в конечном итоге определялась оперирующими хирургами на основе размера опухоли, количества опухоли, внутрипеченочной локализации, местных инвазивных особенностей опухоли при визуализирующих исследованиях, цирроза печени, предполагаемого объема FLR, функции печени и общего состояния пациентов, как сообщалось ранее. , а также на опыте хирурга как на изучении реальной практики. Пациенты находились под регулярным наблюдением после операции. Рецидив/метастазирование опухоли определяли как появление новых поражений, подтвержденных как минимум двумя рентгенологическими методами визуализации, с повышением или без повышения маркеров опухоли в сыворотке.

Среди этих 286 пациентов 125 из EHBH составили обучающую когорту для выявления геномных особенностей, связанных с MVI во вкДНК, и для разработки модели прогнозирования MVI, в то время как остальные 161 пациент из мультицентров (Больница Чжунда Юго-восточного университета, Нанкин; Сунь Ят - Больница памяти Сена Университета Сунь Ят-Суня, Гуанчжоу; Больница гепатобилиарной хирургии Мэнчао Медицинского университета Фуцзянь, Фучжоу; и EHBH, Шанхай) служили в качестве когорты внешней проверки для проверки эффективности модели.

Предоперационные клинические переменные:

Как геномные сигнатуры, связанные с MVI во вкДНК, так и предоперационные клинические переменные, которые, возможно, были связаны с MVI, использовались для идентификации независимых факторов риска MVI для разработки модели прогнозирования MVI. Предоперационные клинические переменные включали возраст, пол, общий билирубин (TBIL), аланинаминотрансферазу (ALT), аспартатаминотрансферазу (AST), альбумин, тромбоциты, протромбиновое время (PT), α-фетопротеин (AFP), протромбин, индуцированный отсутствием витамина K. -II (PIVKA-II), серология гепатита B и C, уровни ДНК HBV и особенности визуализации, такие как количество опухоли, диаметр опухоли и цирроз печени при предоперационной КТ с контрастным усилением и/или магнитно-резонансной томографии (МРТ).

Гистопатологический диагноз MVI:

Хирургически резецированные образцы обычно исследовали гистопатологически после операции. Для обеспечения качества образцов тканей при обнаружении MVI использовался протокол отбора проб из семи мест, рекомендованный отделением патологии Китайского медицинского общества (CMS). Срезы опухолевых и неопухолевых тканей печени исследовали на наличие МВВ. Гистопатологический диагноз MVI соответствовал предыдущим отчетам. Вкратце, МВИ диагностировали при наличии микрососудистого ракового эмбола или гнезда раковых клеток в мелких ветвях воротной или печеночной вены в прилежащих тканях печени, либо в крупных капсульных сосудах, выстланных эндотелием, которые были видны только при микроскопии. В каждом центре использовались одни и те же критерии гистопатологической диагностики МВВ. Ширину хирургического края резекции определяли как ближайшее расстояние между необработанной поверхностью после резекции печени и капсулой опухоли. Все гистопатологические исследования проводились независимо тремя патологами, которые приходили к консенсусу путем обсуждения, если возникали какие-либо разногласия.

Оценка пригодности как для резекций с широким, так и с узким краем Среди 286 пациентов пациенты, перенесшие резекцию с узким краем, были повторно оценены после операции, чтобы определить, подходят ли они также для резекции с широким краем. Три старших печеночных хирурга, которые не знали прогностической информации, рассмотрели предоперационные данные этих пациентов. На основе характеристик визуализации, включая размер опухоли, количество опухоли, состояние капсулы опухоли, внутрипеченочное расположение опухоли, расчетный объем FLR4, степень цирроза, функцию печени, общую работоспособность, а также собственный хирургический опыт. Оценка была основана на технической осуществимости и хирургической безопасности.

Образцы тканей и крови:

Образцы свежих тканей собирали и хранили при температуре -80 ℃ до использования. Периферическую кровь (10 мл на образец) собирали в пробирки EDTA vacutainer за 30 минут до операции, обрабатывали в течение 1 часа после сбора и отделяли центрифугированием при 1600g в течение 10 минут, переносили в микроцентрифужные пробирки и центрифугировали при 20000g в течение 10 минут. минут, чтобы удалить клеточный мусор. И плазму, и лейкоциты собирали и хранили при температуре -80℃ до использования.

Экстракция геномной ДНК и вкДНК:

Геномную ДНК из опухолевых тканей и лейкоцитов экстрагировали с помощью набора DNeasy Tissue or Blood Kit (Qiagen), а затем фрагментировали до размера от 200 до 400 п.н. с использованием Covaris S2 SonoLAB (Covaris). вкДНК выделяли из 3-5 мл плазмы каждого пациента с помощью набора QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen). ДНК экстрагировали в соответствии с инструкцией производителя, количественно оценивали с помощью флуорометра Qubit (Life Technologies) и хранили при температуре -80℃ до использования.

Полноэкзомное секвенирование:

В качестве исходного материала для подготовки библиотеки ДНК использовали 1 мкг ДНК на образец. Библиотека секвенирования была создана с использованием системы обогащения мишеней SureSelect XT для библиотеки секвенирования парных концов Illumina (Agilent), и к каждому образцу были добавлены индексные коды. Образцы геномной ДНК были фрагментированы ультразвуком до среднего размера ~ 400 пар оснований. Фрагменты ДНК были отшлифованы по концам, а-хвосту и лигированы с полноразмерным адаптером для секвенирования с последующей ПЦР-амплификацией. Библиотеки анализировали на распределение по размерам с использованием биоанализатора Agilent 2100 (Agilent). Кластеризация образцов с индексным кодированием была выполнена с использованием системы генерации кластеров cBot (Illumina) в соответствии с инструкциями производителя. После создания кластера ДНК-библиотеки секвенировали на платформе Illumina HiSeq 2000 и считывали мультиплексное секвенирование с парными концами 2×100 нуклеотидов.

Секвенирование целевого гена следующего поколения:

При целевом секвенировании тканей ГЦК с помощью коммерческой панели из 123 генов 100 нг фрагментированной геномной ДНК использовали для создания библиотеки NGS, а для целевого захвата генов использовали зонды, охватывающие кодирующие последовательности 123 генов, часто мутировавших при ГЦК (Baodeng Bio). (Дополнительная таблица 1). Библиотеку NGS секвенировали парными концами длиной 100 п.н. в системе Illumina HiSeq 2000 (Illumina). Средняя глубина охвата для всех зондов составляла не менее 1000×.

При целевом секвенировании лейкоцитов с помощью MVI-PG37 100 нг фрагментированной геномной ДНК использовали для создания библиотеки NGS с использованием набора для создания библиотеки секвенирования KAPA (Kapa Biosystems). Библиотека геномной ДНК NGS была затем захвачена панелью Accu-Act (AccuraGen) и секвенирована с использованием спаренных концов длиной 100 п.н. в системе Illumina HiSeq 2500 (Illumina). Средняя глубина охвата для всех зондов составляла не менее 500×.

При целевом секвенировании вкДНК с помощью панели MVI-PG37 оценку на основе NGS проводили с использованием платформы Firefly (AccuraGen), как сообщалось ранее13. Библиотеки NGS секвенировали в системе Illumina Hi-Seq 2500 (Illumina), а уникальные считывания секвенирования определяли с использованием запатентованного алгоритма AccuraGen. Средняя глубина охвата для всех зондов составляла примерно 7000×.

Биоинформатический анализ данных WES и NGS:

Все данные секвенирования были сопоставлены с эталонной последовательностью человека hg19/GRCh37. Для данных WES соматические мутации, включая SNP и вставки, были идентифицированы алгоритмом MuTect2. MOAF для каждого соматического мутированного гена был рассчитан для скрининга генов, связанных с MVI, с использованием логистического регрессионного анализа, и гены со значением P <0,1 были выбраны в качестве кандидатов для создания генной панели для дальнейшего секвенирования вкДНК. Мутированные гены мутаций зародышевой линии идентифицировали с использованием алгоритма MutSigCV с коэффициентом ложных открытий (FDR) <0,001 в качестве порогового значения при ГЦК с MVI или без него, а затем включали в анализ обогащения на основе базы данных GO и KEGG. Мутированные гены наиболее значительно обогащенных категорий GO/KEGG были сфокусированы, SNP и вставки из этих путей были включены в логистический регрессионный анализ для выявления SNP и вставок, связанных с MVI, со значением P <0,05. Гены, содержащие значимые SNP и вставки, были выбраны в качестве кандидатов на генную панель.

Для данных целевого секвенирования тканей с коммерческой панелью из 123 генов мутации идентифицировали с помощью алгоритма MuTect2. Мутированные гены идентифицировали с использованием алгоритма MutSigCV с FDR <0,05 в качестве порогового значения. MOAF каждого мутантного гена рассчитывали для скрининга генов, связанных с MVI, с использованием модели логистической регрессии со значением P <0,05 в качестве порогового значения.

Для данных целевого секвенирования вкДНК и лейкоцитов фоновый шум, вызванный случайной ошибкой NGS, был удален с помощью запатентованного алгоритма AccuraGen. Данные секвенирования вкДНК и геномной ДНК опухоли были перепроверены с мутацией зародышевой линии из геномной ДНК лейкоцитов для выявления соматических мутаций. MOAF рассчитывали для каждого соматического мутантного гена и использовали в качестве соматических сигнатур. Статус (да/нет) каждого SNP/indel зародышевой линии использовали в качестве сигнатуры зародышевой линии.

Идентификация геномных сигнатур, связанных с MVI, во вкДНК:

Чтобы обнаружить связанные с MVI геномные сигнатуры во вкДНК, сигнатуры, включая MOAF соматических генов и статус (да/нет) мутаций зародышевой линии, подвергали одномерной модели логистической регрессии. Подписи со значением P <0,1 использовались для прямого пошагового многофакторного отбора с использованием критерия максимального индекса соответствия (C-индекс).

Чтобы точно и удобно оценить эффективность идентифицированных сигнатур, связанных с MVI, при прогнозировании MVI, геномные сигнатуры, связанные с MVI, использовали для построения оценки на основе вкДНК с использованием коэффициентов, взвешенных с помощью многомерного логистического регрессионного анализа.

Создание номограммы для прогнозирования MVI Модель номограммы для прогнозирования MVI была разработана с использованием оценки на основе вкДНК и предоперационных клинических переменных, связанных с MVI, в одномерном и многомерном логистическом регрессионном анализе в обучающей когорте. Для построения модели использовались логистический регрессионный анализ и метод опорных векторов. Анализ кривой принятия решений (DCA) использовался для сравнения производительности этих двух алгоритмов машинного обучения. Для построения номограммы использовали пакет программ RMS. Работоспособность модели оценивали по индексу согласованности (C-index) и калибровочной кривой. Внутренняя проверка производительности модели проводилась с использованием перекрестной проверки с исключением одного (LOO) в обучающей когорте, а внешняя проверка проводилась с использованием многоцентровых данных.

Разработка системы повторного стадирования для ранней стадии ГЦК. Был рассчитан общий балл по номограмме каждого пациента, и анализ кривой рабочих характеристик приемника (ROC) был использован для расчета оптимального порогового значения номограммы для различения между высоким и низким риском. для MVI путем максимизации индекса Юдена (т. е. чувствительность + специфичность-1). Точность порогового значения подтверждалась чувствительностью, специфичностью и положительной и отрицательной прогностической ценностью. Используя это пороговое значение, пациенты с ранней стадией ГЦК были стратифицированы на две подстадии с высоким или низким риском MVI, прогнозируемым по неограммам, соответственно.

Статистический анализ:

Клинические конечные точки включали безрецидивную выживаемость (БРВ), которая определялась как время от операции до постановки первого диагноза рецидива или смерти пациента без рецидива; общую выживаемость (ОВ) определяли как время от операции до смерти пациента от любой причины или до последнего наблюдения; а местный рецидив определяли как любой рецидив, расположенный в пределах 2 см от хирургического края резекции. Исходы выживания оценивались с использованием метода Каплана-Мейера и логарифмического рангового критерия. Модель пропорциональных рисков Кокса использовалась для выявления независимых прогностических факторов. Значение P <0,05 считалось статистически значимым, если не указано иное. Статистический анализ выполнен с использованием языка программирования python версии 2.7 (https://www.python.org/). и программное обеспечение R версии 3.1.1 (http://www.r-project.org/).